АКРИДИН-ИПРИТЫ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

ВЕДУЩИЕ СПЕЦИАЛИСТЫ В ОБЛАСТИ ГЕНЕТИКИ

АМЕЛИНААмелина Светлана Сергеевна — профессор кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, доктор медицинских наук. Врач генетик высшей квалификационной категории

 

Прочитать о докторе подробнее

 

 

 

 

 


 

 

дегтерева

Дегтерева Елена Валентиновна — ассистент кафедры по курсу генетики и лабораторной генетики, врач-генетик первой категории

 

Прочитать о докторе подробнее

 

 

 

 

 


 

 

Медицинская генетика

Редактор страницы: Кутенко Владимир Сергеевич

 

 


 

АКРИДИН-ИПРИТЫ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ

Акридин-иприты — новый класс мутагенных соединений, молекулы ко­торых состоят из акридинового кольца и алифатической азотноипритной группы. Как известно, каждая из составных частей их молекулы обладает четко выраженным мутагенным эффектом. Совершенно очевидно, что вещества, сочетающие в себе свойства двух различных классов мутаге­нов, не могли не привлечь внимания генетиков.

Акридин

Акридин

Однако первоначально акридин-иприты были синтезированы для других целей, а именно — как противоопухолевые препараты. Впервые о син­тезе азотноипритных аналогов акрихина, обычно используемого для лече­ния малярии, было сообщено еще в 1959 г. (Peck et al., 1959). Позднее Пек с сотрудниками (Peck et al., 1961, 1964) синтезировали целый ряд веществ, молекулы которых включали акридиновые или хинолиновые кольца и различные алкилирующие соединения.

Антиопухолевая активность некоторых из этих веществ была изучена Кричем (Creech et al., 1960) в Институте исследования рака в Филадель­фии. Было обнаружено, что акридин-иприты подавляют развитие асцит­ных опухолей у мышей. Впоследствии синтез акридин-ипритов проводил­ся в этом институте и акридин-иприты получили кодовые названия — вещества ICR (от трех заглавных букв названия института — Institute of Cancer Research).

Первым из ICR-соединений, использованным в генетических исследо­ваниях, было моноазотноипритное производное акридина — ICR-100, впо­следствии названное ICR-170. Его мутагенная активность была обнару­жена в опытах по индукции мутаций в локусе «dumpy» у Drosophila melanogaster (Carlson, Oster, 1962; Snyder, Oster, 1962; Southin, 1966). Вскоре подобные данные были получены на другом классическом генети­ческом объекте — на сумчатом грибе Neurospora crassa (Brockman, Goben, 1965; Mailing, 1967). Эксперименты Седерофа (Sederoff, 1966) no индукции мутаций в локусе rII фага Т4 под действием ICR-170 показали, что это соединение вызывает мутации типа «сдвиг считывания», или frameshift-мутации, т. е. действует на фаги подобно акридиновым красите­лям (Brenner et al., 1961).

В литературе пока нет сведений о каком-либо особом молекулярном механизме мутагенного действия акридин-ипритов, принципиально отличного от молекулярного действия акридинов. Возможные механизмы мутагенного действия последних широко освещены в литературе, поэтому мы лишь кратко остановимся на них.

Известно из экспериментов по действию на фаг Т4 акридиновых красителей, последние могут внедряться в ДНК и обусловливать возник­новение точечных делеций или вставок. Предполагалось при этом, что мутации возникают в результате ошибок в процессе репликативного синтеза ДНК. Лерман (Lerman, 1961, 1963а, b), исследуя взаимодействие акридинов с ДНК, установил, что акридин внедряется между основания­ми ДНК, их и увеличивая расстояние между ними с 3,4 до 7,0 А. Поскольку молекула ДНК растягивалась на расстояние, равное одному нуклеотиду, то Лерман предложил механизм мутагенеза, соглас­но которому во время репликации ДНК напротив акридинового ядра, расположенного между витками молекулы ДНК, встраивается одно лю­бое лишнее основание. В следующем акте репликации оно достроит себе партнера и процесс вставки лишней пары оснований, а следовательно и сдвига считывания генетического кода на один знак, завершается. Если же во время первого акта репликации акридин внедряется во вновь син­тезируемую нить ДНК, а при втором акте репликации он выпадает, то в такой молекуле ДНК окажется на одно основание меньше, чем в мат­ричной нити, и возникает точечная делеция.

Однако вскоре стало ясно, что не все факты укладываются в эту простейшую «интеркалярную» схему. Прежде всего оставался необъяс­нимым факт, что акридин не проявлял своего мутагенного эффекта на бактериях. Веб и Кубичек (Webb, Kubitschek, 1963) при обработке в тем­ноте клеток Escherichia coli акридиновым оранжевым обнаружили его антимутагенный эффект. В то же время были получены данные о том, что 5-аминоакридин увеличивает частоту прямых и обратных мутаций при обработке клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae в момент мейотического деления, т. е. тогда, когда осуществляется процесс кроссинговера, и проявляет антимутагенный эффект при обработке им клеток в момент митотического деления (Magni et al., 1965). Бойер (Boyer, 1964) описал мутагенную активность профлавина при обработке им бактерий в процес­се трансдукции. Все эти данные приводили к предположению, что акридин-индуцированные мутации могут возникать в результате неравного кроссинговера, частота которого будет увеличиваться, если молекулы акридина внедряются между нуклеотидами ДНК. Подтверждением этих взглядов в значительной степени служит работа Сарабхаи и Ламформа (Sarabhai, Lamform, 1969), установивших, что профлавиновый мутагенез возрастает в присутствии дефектной ДНК-лигазы.

Наиболее четко рекомбинационная гипотеза мутагенного действия акридинов сформулирована в работе Стрейзингера с сотрудниками (Streisinger et ah, 1966). Считая, что рекомбинация у фага Т4 и других фагов осуществляется через формирование внутренних гетерозигот, авто­ры предположили, во-первых, что участки родительских молекул ДНК соединяются водородными связями в местах гетерозиготности и эти участки полностью или частично комплементарны и, во-вторых, что участ­ки, оставшиеся однонитевыми, застраиваются точно так же, как при репарационной репликации. Согласно этой гипотезе, мутации «сдвига считывания» будут возникать тогда, когда одно из вновь застраиваемых оснований не успеет спариться с комплементарным партнером и останет­ся свободным, а к нему сахароводородной связью присоединится другое такое же основание, которое и соединится с соответствующим партнером. Подтверждением этой гипотезы могут служить данные, показывающие, что сдвиг считывания в ДНК происходит в тех районах, в которых имеют­ся участки с повторяющимися нуклеотидами. В этом случае роль акри­динов состоит не столько в том, что он раздвигает молекулу ДНК, а в том, что он стабилизирует ее, благодаря чему срок существования неприсоединившихся оснований увеличивается и следовательно возрастает вероятность комплементарного спаривания следующих оснований.

Однако и рекомбинационная гипотеза акридинового мутагенеза не может объяснить многих фактов, свидетельствующих о том, что процесс рекомбинации не всегда является обязательным условием в индукции мутаций акридинами (Zampieri, Greenberg, 1965; Alderson, Khan, 1968; Stewart, 1968).

АКРИДИН-ИПРИТ-ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ У БАКТЕРИИ

 

Долгое время не удавалось получать мутации у бактерий под дейст­вием акридиновых красителей (Orgell, 1965). Это явление объясняли, как уже выше указывалось, тем, что акридины проявляют свои мутагенные свойства только в рекомбинационных системах, или тем, что обработка акридином по времени не совпадала с репликацией ДНК в бактериаль­ных клетках. Впоследствии нескольким исследователям удалось индуци­ровать мутации у бактерий акридиновыми красителями. Так, Сеснович с соавторами сообщили об индукции мутаций у Escherichia coli профлавином (Sesnowitz et al., 1966). Стюарт (Stewart, 1968) получил мутации при обработке клеток Вас. subtilis акридиновым желтым, а Ньютон с соавторами (Newton et al., 1972) описал мутации у Escherichia coli, индуцированные 5-аминоакридином. Однако эти вещества обладали очень слабым мутагенным действием на клетки бактерий. Поэтому раз­личные исследователи делали попытки получить акридин-индуцированные мутации у бактерий другими путями. Веб и Кубичек (Webb, Kubitschek, 1963) комбинировали действие акридина с облучением видимым светом, т. е. в этих опытах имел место фотодинамический эффект, меха­низм действия которого совершенно иной, чем самого акридина. Другие авторы обратились к акридин-ипритам, тем более, что их мутагенная активность и довольно высокая специфичность действия уже были пока­заны на ряде объектов.

Первая работа на бактериях с использованием в качестве мутагенов ICR-соединений была проведена Эймсом и Вайтфельдом (Ames, Whitefield, 1966), предположившими, что эти вещества имеют оптимальную химическую структуру для индукции frameshift-мутаций. Согласно гипотезе, выдвинутой Бреннером (Brenner et al., 1961) и ос­нованной на экспериментах, проведенных на фагах, мутагены, специфично вызывающие мутации типа «сдвиг считывания», будут индуцировать также только у мутантов, несущих мутации типа «сдвиг считывания». Мутагены же, специфично индуцирующие мутации типа замен sap оснований, должны вызывать реверсии только у мутантов, несущих мутации того же типа. Следовательно, ICR-соедипения, если они действительно вызывают мутации типа frameshift, должны индуцировать ре­версии только у мутантов, несущих эту же мутацию. В работе Эймса и Вайтфельда (Ames, Whitefield, 1966) показано, что ICR-соединения способны повышать частоту реверсий у frameshift-мутантов, но с разной эффективностью. Наиболее сильным мутагенным действием обладали ICR-191, ICR-370 и ICR-372, ICR-364-OH и ICR-372-OH, несущие в бо­ковой цепи молекулы неалкилирующие группы, были менее эффектив­ными.

В этой же работе авторы описали основные свойства мутантов, не­сущих мутации типа «сдвиг считывания». Такие мутанты были отобраны среди штаммов Salmonella typhimurium, имеющих мутации гистидинзависимости, индуцированные различными мутагенами. К предположи­тельным мутантам, несущим мутацию типа frameshift, были отнесены только те, которые не ревертировали под действием алкилирующих со­единений (нитрозогуанидин, диэтилсульфат, азотистый иприт) и мутагенов, вызывающих мутации только за счет замены пар оснований. Из 54 отобранных предположительных frameshift-мутантов ни один не ревертировал под действием вышеуказанных веществ и 49 давали ревер­сии под действием ICR-191. Различные гены гистидинового оперона мутировали с различной частотой под действием ICR-191: так, ICR-ин­дуцированные ревертанты появлялись у 80% frameshift-мутантов, несу­щих мутации в С-гене, и у 90% — несущих мутации в D-гене. Согласно тесту на межаллельную комплементацию, все мутанты, ревертирующие только под действием ICR-191, несли мутации, относящиеся к группе полярных, т. е. к «нонсенс»-мутациям, или к группе некомплементирующих мутаций. Мутанты же, которые ревертировали под действием нитрозогуанидина или 2-аминопурина, несли, по-видимому, мутации, воз­никшие за счет замены пар оснований. Изучение межаллельной ком­плементации показало, что все они относились к группе неполярных, т е. к мутациям «миссенс»-типа.

Frameshift-мутанты отличались от мутантов, несущих мутации типа замены пар оснований, и своим происхождением. Они возникали либо под действием ICR-соединений, либо X-лучей, либо появлялись спонтан­но. Однако ни один из них не был получен под действием веществ, вы­зывающих замены пар оснований. Ни один из предположительных frameshift-мутантов не был способен к фенотипическому исправлению при культивировании на среде с канамицином, неомицином или стреп­томицином, что характерно для мутантов, несущих «миссенс»-мутации (Gorini, Kataja, 1965).

Ни один из изученных спонтанных или ICR-индуцированных ревертантов, полученных у frameshift-мутантов, не возник за счет мутирова­ния генов-супрессоров, т. е. все они возникли в результате либо истин­ных обратных мутаций, либо внутригенных супрессоров. Если реверсии являются результатом истинной обратной мутации, то они возникают за счет вставки (или делеции) на месте ранее существовавшего основания. Если же реверсии возникают за счет мутирования внутригенного супрес­сора, то они будут нести вставку (или делецию) рядом с той вставкой (или делецией), которая привела когда-то к прямой мутации, при этом будет восстанавливаться правильность считывания. Однако в этом слу­чае будет иметься короткий участок в белковой цепи, контролируемый участком гена, заключенным между вставкой и выпадением, полностью отличный по аминокислотному составу от аналогичного полипептидного участка у немутантного штамма. Это, возможно, приведет к снижению энзиматической активности такого белка. Проверка 34 спонтанных ре­версов, полученных у frameshift-мутантов, действительно показала, что 24 из них имели С-фермент меньшей активности, чем у дикого типа, и медленнее росли на минимальной среде, т. е. они, по-видимому, воз­никли в результате frameshift-мутаций во внутригенных супрессорах.

Необычный ICR-191-индуцированный мутант Salmonella typhimurium, несущий мутацию в his D-гене гистидинового оперона, описан Юрно с соавторами (Yourno et al., 1969). По всем признакам это был мутант (D-3018), несущий frameshift-мутацию, характеризующуюся строгой полярностью, неспособностью к фенотипическому исправлению при культивировании на среде с антибиотиками и не ревертирующую под действием 2-аминопурина. Необычность его заключалась, во-первых, в том, что он ревертировал не только под действием ICR-191, но и под действием нитрозогуанидина, и, во-вторых, в том, что он давал две группы реверсов, отличающихся друг от друга способностью трансдуцировать his-оперон в штамм-реципиент, несущий делению по his D-гену. Часть этих реверсов способна была быть донорами при трансдукции, а другая — нет. Эти особенности авторы объясняют следующим образом: клоны, способные к трансдукции, несли истинные обратные мутации или ревертировали за счет мутации внутригенного супрессора. Такие клоны обычно хорошо росли на минимальной среде и продуцировали от 10 до 100% нормального количества фермента гистидиндегидрогеназы, синтез которого находится под контролем гена his D. Клоны же, неспособные к трансдукции, возникали за счет мутации во внешнем гене-супрессоре. Эти клоны характеризовались слабым ростом на минимальной среде и низким уровнем энзиматической активности. Из полученных данных авторы делают вывод, что ICR-191 может индуцировать иногда реверсии за счет мутаций в генах-супрессорах.

Юрно и Хис (Yourno, Heath, 1969) провели биохимическое изучение аминокислотной последовательности в энзиме гистидиндегидрогеназа у спонтанных, ICR-191- и нитрозогуанидин-индуцированных ревертантов штамма his D-3018. Полученные данные свидетельствовали о том, что ICR-191-индуцированный мутант his D-3018 несет frameshift-мутацию, возникшую вследствие вставки одной пары нуклеотидов, вероятнее всего пары Г—Ц, ICR-191 вызывает реверсии за счет выпадеиия этой вставки. Об этом свидетельствует отсутствие различий в аминокислотном составе гистидиндегидрогеназы у реверсов и немутантного штамма. Аминокис­лотная последовательность восстанавливалась и под действием нитро­зогуанидина, который, по мнению авторов, иногда мог вызывать депуринизацию гуанина с последующим удалением пары Г—Ц, что в конечном счете приводило к тем же изменениям, что и при действии ICR-191.

Наиболее детальное изучение природы ICR-индуцированных мутаций в гистидиновом опероне Salmonella typhimurium проведено в работе Ошгера и Хартмана (Oeschger, Hartman, 1970). В качестве мутагенов использовались ICR-191 и ICR-364-OH — азаакридиновое производное, несущее алифатическую неалкилирующую группу. Под действием ICR-191 было индуцировано 48 гистидинзависимых мутантов, под дей­ствием ICR-364-OH — 32. Картирование his-мутаций показало некото­рую специфичность этих мутагенов: his-мутации, индуцированные ICR-191, оказались локализованными в основном в his A, D и F-генах, а ICR-364-ОН-индуцированные мутации — в his С-гене гистидинового опе­рона. 11 мутаций в локусе his С были очень тесно сцепленными; расстоя­ние между ними, определенное на основании экспериментов по рекомби­нации, не превышало 10 нуклеотидных пар. Такая «скученность» харак­терна для мутаций типа frameshift и чаще всего встречается в участках ДНК, богатых повторяющимися парами нуклеотидов.

Все ICR-индуцированные мутанты были изучены по ряду признаков, что позволило авторам разбить их на пять классов.

Мутанты, входящие в I—IV классы, авторы относят к истинным frameshift-мутантам, несущим вставки или выпадения одной или более пар оснований, согласно следующим их свойствам:

  • неспособности давать реверсии под действием 2-аминопурина, спе­цифично индуцирующего замены пар оснований;
  • неспособности к фенотипическому исправлению при культивирова­нии на среде с антибиотиками;
  • неспособности давать реверсии за счет мутаций генов-супрессоров;
  • способности 70% мутантов ревертировать под действием акридин-ипритов;
  • полярности мутаций;
  • отсутствию полярности у ревертантов;
  • отсутствию leaky-мутантов.

 

Мутанты, относящиеся к I классу, по-видимому, несли микроделеции но нескольким парам оснований или двойные frameshift-мутации. Поэто­му они не давали спонтанных и индуцированных реверсий. Прямых дока­зательств того, что акридин-иприты способны вызывать подобные изме­нения в ДНК, пока нет. Однако авторы основывают свое предположение на косвенных данных, полученных, в частности, при картировании his-мутаций. Оказалось, что три ICR-индуцированные мутации являются многосайтовыми и локализованы в одном участке his А гена; 14 мутаций представляли собой делеции по целому оперону из 9 генов.

II класс включал мутанты, дающие только спонтанные реверсии и не ревертирующие под действием ни одного мутагена. Авторы объясняют отсутствие ICR-индуцированных реверсий тем, что мутанты несут делеции по одному или нескольким парам оснований и характеризуются недостаточностью информации, необходимой для осуществления неравного кроссинговера, т. е. процесса рекомбинации, во время которого, вероятно, возникают ICR-индуцированные frameshift-мутации.

К III классу относились мутанты, ревертирующие только под дейст­вием акридин-ипритов. По мнению авторов, они несли «минус» frameshift-мутации, т. е. делеции по одной паре оснований. У ревертантов вос­станавливалась правильность считывания либо за счет истинной обратной мутации, либо за счет индукции внутригенного супрессора.

IV класс, самый многочисленный, включал мутанты, которые ревертировали не только под действием ICR-соединений, но и под действием нитрозогуанидина и диэтилсульфата, т. е. мутагенов, обычно не индуци­рующих вставок-выпадений оснований ДНК. Однако по остальным свойствам это были типичные frameshift-мутанты, не ревертирующие под действием 2-аминопурина. Авторы объясняют свойства этого класса му­тантов тем, что эти мутанты несут «плюс» frameshift-мутации, т. е. встав­ки по одной паре оснований ДНК. Нитрозогуанидин и диэтилсульфат способны, по-видимому, за счет депуринизации, как это уже было пока­зано на мутанте his D-3018 (Yourno, Heath, 1969), иногда вызывать точечные делеции, приводящие к выпадению лишней пары оснований, вероятнее всего пары Г—Ц. Еще не ясно, может ли под действием этих веществ удаляться пара А—Т. На основании полученных данных авторы приходят к заключению, что когда исследователи получают реверсии у акридин-иприт-индуцированных мутантов, как под действием ICR, так и под действием нитрозогуанидина, необходим дальнейший анализ изучае­мых мутаций.

Два мутанта, составляющие V класс, по мнению авторов, возникли спонтанно и, по-видимому, несут «миссенс»-мутации. Однако не исклю­чена возможность, что акридин-иприты изредка могут вызывать мутации, имитирующие замены пар оснований, при возникновении близколежащих вставок-делеций в определенной нуклеотидной последовательности.

Акридин-иприт-индуцированный мутагенез интенсивно изучается и в исследованиях, проводимых на кишечной палочке (Berger et al., 1968; Newton, 1970; Herman, Dworkin, 1971; Newton et al., 1972). Особый инте­рес представляют работы, в которых делаются попытки выяснить зави­симость между ICR-индуцированным мутагенезом и такими явлениями, как репликация, репарация и рекомбинация, так как именно с ними в настоящее время связывают предположительные механизмы возникновения frameshift-мутаций. Если ошибки, возникающие в процессах рекомбинации, репарации или репликации ДНК, приводят к появлению такого типа мутаций, то у штаммов, несущих мутации, блокирующие эти процессы, frameshift-мутанты должны индуцироваться с меньшей частотой, чем у немутантных штаммов. Именно такой подход был использован в работая Германа и Дворкина (Herman, Dworkin, 1971), в которой изучался штамм Escherichia coli, несущий мутацию rec А, блокирующую процесс рекомбинации, и ICR-191-индуцироваиную мутацию lac. Учитывалась частота Lac-ревертантов, индуцированных ICR-191, у штаммов rec А с нормальной системой рекомбинации в присутствии и отсутствии lac-индуктора. Показано, что мутация rec А не оказывала никакого влияния на частоту Lас-реверсий.

Подобные данные получены и в работе Ньютона с соавторами (Newton et al., 1972), которые также использовали штаммы Е. coli, несущие мутацию lac и одновременно мутации rec А или В, uvr А или uvr В. По­следние две мутации блокировали первый этап репарационной системы выщепления — ресинтеза. В качестве мутагенных агентов использовали ICR-191 и 5-аминоакридин. Учитывалась частота Lac-ревертантов. Оказалось, что 5-аминоакридин обладает значительно более слабым мутагенным действием по сравнению с ICR-191. Авторы объяс­няют эти различия в мутагенной активности более прочным внедрением молекул ICR-191 в молекулу ДНК вследствие образования ковалентных связей алкилирующей группой акридин-иприта. Для возникновения frameshift-мутаций не требуется интактной системы рекомбинации, поскольку они появляются с приблизительно рав­ной частотой у rec А, rec В и rec+ штаммов. В то же время частота ICR-191-индуцированных реверсий у штаммов, несущих мутации uvr А и uvr В, возрастала по сравнению со штаммом uvr+ в 10 раз при одина­ковой спонтанной частоте у всех трех штаммов. Авторы дают два воз­можных объяснения этому явлению: во-первых, недостаточные по репа­рации мутанты могут обладать каким-то добавочным механизмом frameshift-мутагенеза, благодаря которому ICR-191 индуцирует мутации независимо от процесса репликации; во-вторых, uvr-штаммы, возможно, потеряли способность к удалению включившихся в ДНК молекул ICR-191, тогда акридин-иприт, связанный с lac-опероном, будет причиной возникновения frameshift-мутаций в процессе репликации этих генов.

Эксперименты по изучению связи репликации ДНК с акридин-иприт-индуцированным мутагенезом проводились на lac и trp (триптофанзависимых) штаммах, несущих frameshift-мутации. В определенных условиях, в которых был синхронизирован процесс репликации ДНК, удалось уста­новить, что пик частоты реверсий приходился на 21-ю минуту репликационного цикла для lac-мутантов и на 29-ю минуту — для trp-мутантов. Второй пик для lac-мутантов приходился на 64-ю минуту, т. е. когда наступал второй цикл репликации. Эти данные, по мнению авторов, свидетельствуют в пользу связи менаду процессом репликации и процес­сом возникновения frameshift-мутаций.

В этом разделе обзора, по-видимому, будет уместно сказать нескрльг ко слов о влиянии на мутационный процесс веществ, близких по струк­туре к акридин-ипритам. Целая группа (около 200) таких веществ, в молекулы которых входили 6-хлор-2-метоксиакридин, 7-хлорквиналин, бензаквиналин, бензакридин с различными по структуре боковыми це­пями, содержащими аминогруппы, была испытана на мутагенную актив­ность (Bach, Johnson, 1971). В качестве тест-объекта использовали штаммы Е. coli, несущие мутаторный ген Треферса. Большинство из испытанных соединений обладало антимутагенным эффектом.

Необходимо также упомянуть о работах, в которых установлена связь между канцерогенезом и frameshift-мутагенезом. Показана спо­собность некоторых эпоксидов канцерогенных полициклических угле­водородов вызывать мутации в his-опероне Salmonella typhimurium (Ames et al., 1973). Известно, что полициклические углеводороды спо­собны включаться в ДНК и превращаться в эпоксиды микросомными энзиматическими системами. Высокоактивные канцерогенные эпоксиды углеводородов оказывались и эффективными мутагенами, что особенно четко продемонстрировано на uvr-мутантах, несущих, кроме того, му­тацию, приводящую к уменьшению количества липополисахаридов в бактериальной оболочке и тем самым обеспечивающую беспрепятствен­ное проникновение в клетки молекул мутагена. Вторая работа посвяще­на изучению мутагенного действия целой серии канцерогенных веществ, активированных ферментами, содержащимися в гомогенатах клеток пе­чени (Ames et al., 1973). В качестве тест-объекта были использованы гистидинзависимые frameshift-мутанты Salmonella typhimurium, которые давали реверсии только под действием веществ, способных вызывать мутации типа «сдвиг считывания». Было показано, что 18 из 20 фермент-активированных канцерогенов обладали мутагенным действием и с до­статочно высокой частотой индуцировали реверсии у frameshift-мутантов Salmonella typhimurium.

 

АКРИДИН-ИПРИТ-ИНДУЦИРОВАННЫЙ МУТАГЕНЕЗ У ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ ОРГАНИЗМОВ

 

Как уже указывалось, мутагенная активность акридин-ипритом впервые была продемонстрирована при индукции мутаций в локусе dumpy у Drosophila malanogaster (Carlson, Oster, 1962; Snyder, Oster,. 1964; Southin, 1966; Carlson et al., 1967). В этих работах показано, что ICR-170 индуцирует высокую частоту мутаций в локусе dumpy (до 1%) при инъецировании самцов 0,1%-ным раствором мутагена. Мутанты очень часто (до 95%) оказывались мозаичными при воздействии мута­геном на девятидневных самцов, полные же мутанты чаще возникали при обработке самцов более старшего возраста. Показано также, что ICR-170 подобно Х-лучам индуцирует сцепленные с полом рецессивные летальные мутации с частотой до 13%. Однако в противоположность Х-лучам, ICR-170 не вызывает крупных хромосомных перестроек. Пре­обладание мозаичных мутантов, отсутствие крупных хромосомных пере­строек, нечувствительность ICR-170-индуцированных мутантов к повы­шенной температуре — все это позволяет авторам выдвинуть предполо­жение, что ICR-170 взаимодействует с одной нитью ДНК и мутации ошибки репликации и рекомбинации, т. е. что ICR-170 и у Drosophila melanogaster индуцирует мутации типа вставок-выпадений оснований.

Показана способность ICR-170 индуцировать мутации и у высших растений. Кумар с соавторами (Kumar et al., 1967) обнаружили, что под возникают хромосомные перестройки у проростков Vicia faba.

Описаны также хромосомные перестройки, индуцированные акридин-хромосомах слюнных желез Drosophila melanogaster (Kumar, Sharma, 1967), Однако на основании приведенных в данных ничего нельзя сказать о возможных механизмах мутагенного действия акридин-ипритов.

Наиболее интересные работы по изучению мутагенного действия акридин-ипритов на эукариотические организмы выполнены на грибах-аскомицетах — Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae и Shizosaccharomyces pombe. В этих исследованиях пока не получено однозначного ответа о типах акридин-иприт-индуцированных мутаций.

Одна из первых работ по акридин-иприт-индуцированному мутагене­зу у Neurospora crassa принадлежит Маллингу (Mailing, 1967). Была изучена способность ревертировать под действием ICR-170 8 аденинзависимых (ad-3В) мутантов, о которых было известно, что 4 из них мог­ли ревертировать только за счет замены пар оснований, 2 — за счет вставок — выпадений, а 2 — ревертировали только спонтанно, т. е. меха­низм возникновения реверсий в последнем случае не был определен. Обнаружено, что под действием ICR-170 с наибольшей частотой ревертировали мутанты, возникшие за счет вставок — выпадений и с наименьшей — за счет замен пар оснований. В этой же работе была сделана попытка определить, какая из частей молекулы ICR-170 (акридин или азотистый иприт) оказывает большее влияние на индукцию. Для этого изучалась мутагенная активность следующих соединений: 1) акрихина; 2) ICR-174 и ICR-172 — веществ, несущих ту же алифати­ческую ипритную группу, что и ICR-70, но отличающихся от последнего числом шестичленных колец (ICR-174 имело 2 правых кольца из трех, а ICR-172 — 2 левых); 3) ICR-177 — монофункционального азотистого иприта. Показано, что акрихин не вызывает мутаций у Neurospora cras­sa; ICR-172 и ICR-174 обнаруживали значительно более слабую неспе­цифическую мутагенную активность по сравнению с ICR-170; ICR-177 как алкилирующее соединение индуцировал реверсии у всех мутантов, несущих мутации типа замены пар оснований, и у одного мутанта, не­сущего вставки — делеции. Из этих данных авторы делают вывод, что для специфичного акридин-иприт-индуцированного мутагенеза необхо­димы интактные акридиновая и ипритная группы. Эти данные подтверж­дены рядом авторов (Carlson et al., 1967; Brusick, 1969; Ong, 1970).

Анализ аденинзависимых ICR-170-индуцированных мутантов у Neurospora crassa позволил выявить их некоторые свойства (Ong, 1970). Частота возникновения мутантов составляла 187 и 2287 на 106 выжив­ших клеток при обработке конидий растворами, содержащими 1 и 5 мг ICR-170 в 1 мл, при выживаемости 84 и 28% соответственно. Только 5,3% всех мутантов были типа leaky. Скрещивание с тестерными штам­мами, несущими делеции, показало, что ICR-170, подобно нитрозогуанидину, индуцирует внутригенные изменения, а не хромосомные пере­стройки. Тест на межаллельную комплементацию позволил классифи­цировать мутанты на 2 группы: 23,8% несли комплементирующие мута­ции, 76,2% — некомплементирующие. Комплементирующие мутации по характеру комплементации были подразделены на полярные — 64,5% (нонсенс-мутации) и неполярные — 35,5% (миссенс-мутацни).

На основании этих данных авторы приходят к выводу, что ICR-170 может индуцировать либо внутригенные делеции, либо мутации типа точечных вставок — выпадений (frameshift-мутации), либо замены пар оснований, приводящие чаще к возникновению мутаций типа нонсенс или реже — типа миссенс.

Дальнейший анализ ICR-170-индуцированных мутантов у Neurospora crassa позволил Брусику (Brusick, 1969) прийти к выводу, что этот мутаген индуцирует в основном мутации типа frameshift. Автором изу­чена способность к реверсии у 24 ICR-170-индуцированных мутантов под действием ICR-170 и азотистой кислоты, которая, как известно, вызы­вает мутации за счет замены пар оснований типа транзицнй. 16 из 24 мутантов четко ревертировали только под действием ICR-170. ствием азотистой кислоты 11 мутантов не ревертировали, 13 — ревертировали очень слабо. 23 мутанта из 24 давали спонтанные реверсии. На основании этих данных автор делает следующие заключения: 1) ICR- должно индуцировать односайтовые мутации, а не делеции, поскольку почти все мутанты ревертируют спонтанно; 2) эти односайтовые мутации не должны быть транзициями, так как мутанты не давали четкого повы­шения частоты реверсий под действием азотистой кислоты; 3) способность большинства мутантов давать реверсии под действием ICR-170 по аналогии с данными, полученными на бактериях, свидетельствует о том, что этот мутаген индуцирует в основном frameshift-мутации. Автор не исключает возможности возникновения реверсий за счет внутригенных супрессорных мутаций, тесно сцепленных с сайтом исходной мутации ad-3.

Подобные данные получены при изучении ICR-170-индуцированных мутаций в локусе pyrimidine-3 у Neurospora crassa (Radford, 1969).

Дальнейшее изучение ICR-индуцированного мутагенеза у грибов проводилось преимущественно на клетках дрожжей. Дрожжи как объект для таких исследований имели некоторые преимущества по сравнению с нейроспорой: дрожжи, как и нейроспора, являются типичными (эукарио­тами, но в отличие от последней могут мутировать под действием акридиновых красителей (Magni et al., 1965), которые, как известно, индуцируют мутации типа «сдвиг считывания».

Результаты реверсионного анализа у ICR-170-индуцированных му­тантов дрожжей очень сходны с таковыми у Neurospora crassa. Пока­зано, что большинство мутантов ревертировали под действием ICR-170 и не ревертировали под действием нитрозогуанидина, т. е. большинство мутантов, по-видимому, несло мутации типа frameshift. Однако 2 мутан­та ревертировали под действием обоих мутагенов. По мнению автора, они являются исключениями, появление которых можно объяснить либо тем, что они возникают как истинные обратные мутации за счет замены пар оснований, индуцируемых нитрозогуанидином, либо за счет frames­hift-мутации в супрессорном гене, индуцируемой ICR-170 (Brusik, 1969, 1970, 1972).

Еще одно доказательство того, что ICR-170 индуцирует frameshift-мутации, получено этим же автором в работе по индукции циклогексимидустойчивых мутантов у Saccharomyces cerevisiae (Brusick, 1972). Циклогексимид — антибиотик, продуцируемый грибом Streptomyces griseus. Известно, что он подавляет на 80—90% синтез белка у дрожжей. Механизм его действия, по-видимому, состоит в том, что он ингибирует транспортными РНК. Хотя специфический участок в РНК рибосом, который взаимодействует с антибиотиком, пока не идентифицирован, но изучение циклогексимидустойчивых клеток пока­зало изменение физических свойств рибосом по сравнению с немутант­ными клетками (Rao, Grollman, 1967; Sisler, Siegal, 1967). По этим свойствам циклогексимид очень сходен с действием стрептомицина и спектиномицина на клетки Escherichia coli. Известно, что устойчивость Е. coli к последним двум антибиотикам обеспечивается миссенс-мутациями, т. е. мутациями, возникающими за счет замены пар оснований. По аналогии с этим следовало ожидать, что циклогексимидустойчивые мутанты (CyhR) также будут нести миссенс-мутации, т. е. будут индуци­роваться такими мутагенными факторами, как нитрозогуанидин, и не будут возникать под действием ICR-170, если последний индуцирует frameshift-мутации. Для сравнения была изучена еще одна мутация — устойчивости к канаванину (CanR), возникающая как за счет замены пар оснований, так и за счет «сдвига считывания».

Как и ожидалось, результаты исследований показали, что ICR-170 почти не индуцирует CyhR-мутаций по сравнению с нитрозогуанидином. Оба мутагена достаточно эффективно вызывали появление CanR-мутантов. Поскольку проявление фенотипов CyhR и CanR зависело от синтеза «продукта» гена устойчивости, то были проведены дополнительные экс­перименты для максимального выявления мутантов. Для этого клетки отмывали От мутагена, культивировали в жидкой питательной среде от 0 до 120 мин., а затем высевали на селективную среду. Такая постобра­ботка значительно (от 8 до 38 раз в зависимости от времени) увеличи­вала частоту , индуцированных нитрозогуанидином CyhR мутантов и только в 2 раза —индуцированных ICR-170. Постобработка вызывала слабое возрастание частоты мутаций CanR, индуцированных обоими му­тагенами.

Эти данные, по мнению автора, свидетельствуют о том, что и ICR-170 в редких случаях может индуцировать миссенс-мутации. Изучение ча­стоты ICR-170-индуцированных CyhR и CanR-мутантов в зависимости от фазы роста обрабатываемых клеток показало, что при обработке кле­ток в логарифмической фазе роста частота CyhR не возрастала, а CanR — была даже ниже, чем при обработке клеток в стационарной фазе. Результаты можно объяснить тем, что в логарифмической фазе идет интенсивный синтез белка и в это время может накопиться в зна­чительном количестве «продукт» гена чувствительности к антибиотику. Если в этом случае даже и индуцируется мутация устойчивости, то предшествующий генный продукт делает клетку чувствительной к среде с антибиотиком и вызовет гибель клетки раньше, чем новые устойчи­вые мутанты проявятся. Голодные клетки в стационарной фазе будут иметь незначительное количество «продукта» гена чувствительности и будут в состоянии синтезировать «продукты» мутантных генов устойчи­вости при высеве на селективную среду с антибиотиком. В этом случае все устойчивые мутанты проявятся. Отсюда следует, что стационарная и логарифмическая фазы клеточного развития отличаются не по чувст­вительности к мутагенному действию ICR-170, а по способности к фено­типическому проявлению возникающих мутаций. Как уже указывалось, генетические и биохимические исследования подтвердили предположе­ние об аналогии мутаций циклогексимидустойчивости у дрожжей мута­циям стрептомицинустойчивости у Е. coli. Те и другие являются миссенс-мутациями и возникают в результате элиминации под действием генного фактора, например нитрозогуанидина, участка рибосомы, с ко­торым реагирует циклогексимид; при этом изменяется способности к белковому синтезу, но клетка остается жизнеспособной. Такого типа мута­ции не возникают под действием ICR-170, так как это соединение, видимо, индуцирует вставки—выпадения нуклеотидов, что приводит к таким изменениям рибосомной структуры, в результате которых клетки гибнут.

Как и в экспериментах, проводимых на бактериях, реверсионный анализ широко применяется в исследованиях по определению типа му­таций у дрожжей. Как известно, работы, в которых учитывается количе­ственный выход ревертантов при посеве обработанных мутагеном кле­ток на селективные среды, весьма трудоемки. Поэтому несколькими ав­торами был предложен экономичный метод классификации мутантов (Pittman, Brusick, 1971; Brusick, Zeiger, 1972). Клетки ауксотрофных мутантов дрожжей в логарифмической фазе роста высевали на мини­мальную среду с добавлением 0,02% дрожжевого автолизата. Послед­нее давало клетке возможность пройти несколько делений, что эконо­мило время для предварительной инкубации клеток. В центр засеянной чашки Петри помещался бумажный диск, смоченный в растворе мута­гена. В том случае, когда мутаген индуцировал реверсии у определен­ного мутанта, вокруг диска вырастали прототрофные колонии. Сравне­ние этого метода с обычным методом учета реверсий показало их пол­ное совпадение.

Используя «чашечный» метод, Питман и Брусик (Pittman, Brusick, 1971) проанализировали большое число ауксотрофных мутантов, инду­цированных различными мутагенными факторами, по способности ревертировать под действием ICR-170 и нитрозогуанидина, и на этом основании классифицировали их по типам изменений в ДНК, приводящим к мутациям.

На основании полученных данных авторы приходят к выводу, что те мутанты, которые ревертируют только под действием ICR-170, несут мутации типа frameshift, нитрозогуанидина — замены пар оснований, под действием обоих мутагенов — могут нести мутации типа frameshift (тогда нитрозогуанидин вызывает депуринизацию и выпадение одной пары нуклеотидов), либо мутации типа замены пар оснований, тогда ICR-170 может в редких случаях вызывать замены пар оснований.

«Чашечный» метод классификации мутантов использовался также для доказательства одинаковой природы мутаций, вызываемых различными мутагенными факторами у дрожжей Saccharomyces cerevisiae и у бактерий Salmonella typhimurium.

В наших исследованиях проводилось сравнительное изучение леталь­ного и мутагенного действия на клетки дрожжей Saccharomyces cerevi­siae двух акридин-ипритов: аналогичного ICR-170 акридин-иприт однозамещенный — АИОЗ) и аналогичного одному из красителей Касперсона (Caspersson, 1969) (акридин-иприт двузамещенный — АИДЗ). Оба мутагена были синтезированы Г. Н. Бондаревым и любезно предостав­лены для работы.

В наших экспериментах была показана более высокая мутагенная активность АИДЗ в отношении индукции прямых мутаций аденинзависимости в локусах ade-1 и ade-2, а также реверсий по потребности в аденине. Эти результаты могут быть объяснены большей алкилирующей способностью АИДЗ, в молекуле которого имеются две β-хлорэтильные группы, в то время как у АИОЗ — только одна. Возможно вследствие этого АИДЗ более прочно связывается при внедрении с молекулой ДНК, что и служит причиной возникновения мутаций. Различий между мутагенами по частоте индукции мутаций в локусах ade-1 и ade-2 не на­блюдалось. Комплементационный анализ АИ-индуцированных мутаций в локусе ade-2 показал высокую мутагенную специфичность обоих ве­ществ, вызывающих в подавляющем большинстве некомплементируян щие мутации. Из 81 АИОЗ-индуцированных мутантов 74 несли мутации в локусе ade-2, относящиеся к классу некомплементирующих, 6 — к классу комплементирующих и 1 — к классу полярных мутаций. Из 50 ade-2 мутаций, индуцированных АИДЗ, 49 были некомплементирующими и 1 — комплементирующей.

Ни один из изученных мутантов не являлся leaky-мутантом. Около 60% индуцированных мутантов ревертировали под действием акридин-ипритов и, как показали исследования Хромова-Борнсова и Симарова (1973), ни один из АИ-индуцированных мутантов не ревертировал под действием оксиаденина, являющегося высокоспецифичным мутагеном, индуцирующим мутации типа замены пар оснований. При изучении природы АИ-индуцированных реверсий было обнаружено, что они возника­ют за счет истинных обратных мутаций или в результате индукции внутригенных супрессоров, но ни в одном случае реверсии не появлялись за счет мутаций внегенных супрессоров.

Сравнение полученных нами данных с литературными позволило предположить, что оба использованных мутагена индуцируют в гапло­идных клетках дрожжей Sacch. cerevisiae мутации типа «сдвига считы­вания».

Во всех вышеприведенных работах изучались индуцированные акридин-ипритами ядерные мутации. Однако недавно было показано, что эти соединения способны вызывать и цитоплазматические мутации у дрож­жей (Werkhiser, Pittman, 1972). Учет выживаемости и частоты мутаций дыхательной недостаточности указывал на большую чувствительность к действию ICR-170 клеток, находящихся в логарифмической фазе рос­та. При этом возникали в основном секторные колонии, а в стационар­ной фазе — целые колонии. Эти данные авторы объясняют тем, что ICR-170, по-видимому, индуцирует мутации, характеризующиеся задерж­кой их фенотипического проявления. Изучение природы индуцирован­ных дыхательных мутантов позволило подразделить их на 3 класса: ядерные (pet, р+), цитоплазматические (РЕТ, р) и двойные (pet, р). Все спонтанные мутанты оказались цитоплазматическими. Из 499 ин­дуцированных мутантов 71 были ядерными, 417 — цитоплазматически­ми, 2 — двойными, 9 — не скрещивались ни с одним из имеющихся тес­теров и их природа не была определена. Теоретический расчет вероят­ности возникновения двойных мутантов очень близок к частотам, полу­ченным в экспериментах. Большинство ядерных мутаций были неаллельны 7 тестерным pet-мутациям.

Очень детальное изучение природы ICR-170 индуцированных мутан­тов проведено еще на одном представителе класса аскомицетов — Shizosaccharomyces pombe (Munz, Leupold, 1970; Segal et al., 1973). Были исследованы ICR-170-индуцированные мутанты, несущие мутации в локусах ad-1, ad-6 и ad-7, а также для сравнения изучались мутанты, индуцированные нитрозогуанидином, этилметансульфонатом и азоти­стой кислотой.

Все изученные мутанты авторы попытались разбить на 2 группы: не­сущие мутации типа замены пар оснований и несущие мутации типа «сдвига считывания». Для подобной классификации были использованы следующие критерии: 1) чувствительность к повышенной температуре и способность к осмотическому восстановлению функции; 2) способность ревертировать за счет индукции нонсенс-супрессоров amber и ochre-типов; 3) способность ревертировать под действием нитрозогуанидина и ICR-170; 4) способность к межаллельной комплементации. Мутации неполяр­ные, комплементирующие, температурочувствительные или осмотически восстанавливаемые, по мнению авторов, относятся к миссенс-мутациям, обусловленным заменой пар оснований. Мутации полярные, или некомплементирующие, супрессируемые одним из нонсенс-супрессоров, отно­сятся к нонсенс-мутациям, также возникшим за счет замены пар осно­ваний. Способность ревертировать под действием нитрозогуанидина ука­зывает на то, что мутант возник за счет либо нонсенс-, либо миссенс-мутации. Мутации полярные, или некомплементирующие, дающие реверсии под действием ICR-170 с частотами, не менее чем в 100 раз пре­вышающими контроль, и не показывающие свойств мутаций типа замены пар оснований, по мнению авторов, относятся к истинным frameshift-мутациям. Мутанты, не входящие в эти 2 группы, отнесены авторами в группу мутантов неизвестной природы. На основании вышесказанного авторы классифицировали все изученные ими мутанты.

Из полученных данных авторы делают 2 вывода:

  • нитрозогуанидин всегда, а этилметансульфонат в подавляющем большинстве случаев индуцируют мутации типа замены пар оснований;
  • ICR-170 не является высокоспецифичным мутагеном и способен индуцировать как мутации типа замены пар оснований, так и frameshift-мутации.

Последний вывод противоречит подавляющему большинству данных, полученных на различных объектах, о том, что ICR-170 индуцирует в основном мутации типа frameshift. Это противоречие может быть объяс­нено тем, что авторы несколько иначе подошли к критериям классифи­кации frameshift-мутаций, считая, что истинные frameshift-мутанты дол­жны ревертировать под действием ICR-170 с частотами, в 100 и более раз превышающими спонтанный уровень. Они основывались на данных Маньи (Magni et al., 1965) о том, что мутанты, ревертирующие с мень­шей частотой, должны возникать якобы не за счет действия акридина, а за счет действия ипритной группы молекулы ICR-170. Различия в от­носительной частоте ICR-170-индуцированных мутантов, несущих раз­ные локусы, по мнению авторов, не могут быть объяснены без детально­го рекомбинационного анализа, который позволил бы дифференциро­вать гетеро- и гомоаллельные мутации в каждом из локусов. Тогда мож­но было бы расшифровать возможные механизмы, обеспечивающие чув­ствительность отдельных локусов к мутагенному действию ICR-170.

Не получено также доказательств того, что ICR-170 индуцирует в ос­новном мутации типа frameshift у Aspergillus nidulans (Alderson, 1969). Изучалась способность давать реверсии под действием ICR-170, нитрозогуанидина и диэтил сульфата у 17 ICR-170-индуцированных мутантов, несущих мутации в различных локусах, контролирующих синтез фер­мента ксантингидрогеназы. Оказалось, что 10 из 17 мутантов ревертировали как спонтанно, так и под действием всех трех мутагенов, 3 — ревертировали только спонтанно, а 1 — никогда не ревертировал. Из всех Дезертирующих, по мнению авторов, только один мутант мог нести frameshift-мутацию, так как частота ICR-170-индуцированных реверсий у него значительно превышала частоту нитрозогуанидин- и диэтилсульфат-индуцированных ревертантов.

При анализе изменчивости по признаку реверсибильности у ICR-170-индуцированных мутантов не обнаружено значительного влияния принадлежности к разным локусам на частоту реверсий. Ревертанты, по мнению автора, возникают в основном за счет истинных обратных му­таций или за счет индукции генов-супрессоров, тесно сцепленных с мутантными локусами. Различия между собственными данными и данны­ми других авторов Алдерсон пытается объяснить тем, что у Asoergillus nidulans реверсии индуцировали при низкой выживаемости (10%), в то время как, например, у Neurospora crassa — при высокой выживаемости (80—90%). Тогда возможно, что в данной работе мутагенная актив­ность ICR-170 была обусловлена не акридиновой, а ипритной группой молекулы ICR-170, в то время как frameshift-мутанты, возникающие при высокой выживаемости, не были учтены.

В литературе в настоящее время почти отсутствуют сведения о влиянии процессов, с которыми связывают возникновение frameshift-мутаций, а именно процессов репликации, репарации и рекомбинации на акридин-иприт-индуцированный мутагенез у эукариот. Нами уже упоминалась работа Маньи (Magni, 1964), в которой продемонстрируем вано мутагенное действие акридина в процессе мейоза, т. е. тогда, ког­да протекает процесс рекомбинации. Недавно появилась работа Леблона (Leblon, 1972), установившая определенное влияние особенностей ICR-170-индуцированных мутаций на процесс генной конверсии у Ascobolus immersus. У этого гриба были индуцированы аскоспоровые мутан­ты, отличающиеся от дикого типа цветом спор. В качестве мутагенных факторов использовались ICR-170, нитрозогуанидин и этилметансульфонат. Учитывались мутации в двух независимо наследуемых локусах b1 и b2,. Генная конверсия изучалась при анализе потомства от скрещива­ния мутантов с диким типом. Учитывалась частота асков с неменделевским расщеплением по признаку окраски спор среди аскоспорового по­томства, т. е. частота асков, дающих расщепление, отличное от 4 му­тантных (м) : 4 дикого типа (д.т.). Такие аски классифицировались по двум-критериям: 1) по времени расщепления, т. е. имело место мейотическое (6 м : 2 д. т. или 2 м : 6 д. т.) или постмейотическое расщепление (5 м : 3 д. т. или 5 д. т.: 3 м); 2) по направлению конверсии — либо к ди­кому типу, т. е. к преобладанию аскоспор дикого типа (6 д. т. : 2 м или 5 д. т. : 3 м), либо к мутантному типу (6 м : 2 д.т. или 5 м : 3 д.т.). На основании этих критериев был изучен спектр типов конверсии в зависи­мости от происхождения взятых в скрещивания мутантов. Из полученных данных следует, что ICR-170 и нитрозогуанидин являются довольно строго специфичными мутагенами, вызывающими мутации, которые оказывают четко выраженное влияние на процесс генной кон­версии: ICR-170 индуцирует мутации, которые понижают частоту появле­ния асков с постмейотическим расщеплением и повышают частоту конверсии к мутантному типу (В-Тип); нитрозогуанидин-индуцироваиные мутации повышают частоту возникновения асков с постмейотическим расщеплением и с преобладанием конверсии к дикому типу (С-тип). Менее специфичное влияние на генную конверсию оказывают мутации, индуцированные этилметансульфонатом. Существенным недостатком проведенных исследований является то, что под действием каждого мутагена  было проанализировано мало асков.

Иногда встречались аски, дающие расщепление 7м : 1 д.т., или 8м.: Од. т., или 7д. т.: 1 м., или 8 д. т. — 0 м. В этом случае, по-видимому, в процесс кон­версии включается не одна, как обычно, из сестринских хроматид, а обе хроматиды. Вероятность появления асков с подобным расщеплением равна произведению вероятностей по­явления асков, в которых одна хроматида принимает участие в конверсии.

Автор пытается объяснить полученные им результаты на основе имеющихся в литературе гипотез о механизмах генной конверсии. Исходя из моделей генной конверсии, не включающих как обязательный этап коррекцию ошибочных оснований в «гибридной» ДНК (Stahl, 1969; Paszewski, 1970), отсутствие постмейотического расщепления в асках мутантов может быть объясне­но тем, что мутация предотвращает образование гетеродуплексов. Направленность конверсии в этом случае зависит от природы мутаций, которая играет, по-видимому, роль в выборе хроматиды, вклю­чающейся в процесс конверсии.

Согласно моделям генной конверсии Холидея (Holliday, 1964) и Ха­стингса и Уайтхауза (Hastings, Whitehouse, 1964), в результате коррек­ции ошибочных оснований в «гибридной» ДНК может восстанавливать­ся «гомозиготность». Если же «гетерозиготность» по данному участку ДНК не будет таким образом устранена, то это приведет непосредственно к постмейотическому расщеплению. Возможно, что крупные нарушения в структуре ДНК ведут к преобладанию асков с постмейотическим расщеплением. Эти гипотезы объясняют и строгую асимметрию в на­правленности конверсии, если предположить, что одна из нитей ДНК исправляется чаще, чем другая.

В своих исследованиях мы впервые сделали попытку выяснить зависимость между акридин-иприт-индуцированным мутагенезом и процессом рекомбинации у эукариот (Федорова, Бондарев, 1974). Для этой цели был изучен летальный и мутагенный эффекты АИДЗ Дакридин-иприт двузамещенный) на трех радиочувствительных штаммах дрожжей Saccharomyces cerevisiae, несущих мутации uvs1 (блокирует выщепление димеров пиримидинов), xrs1 и xrs2 (нарушают работу системы рекомбинационной репарации). Штаммы uvs1 и xrs2 рактеризовались очень высокой чувствительностью к летальному действию АИДЗ, xrs1 не отличался по этому признаку от контрольного штамма. По частоте возникновения аденинзависимых мутантов только штамм uvs1 значительно превосходил контрольный штамм. У штаммов xrs1 и xrs2 выход мутаций не отличался от контроля. Полученные нами данные По комплементационному анализу свидетельствуют о том, что все ade-2 мутанты у всех радиочувствительных штаммов несли только некомплементирующие мутации. Все эти результаты хорошо согласуются с ранее опубликованными данными о частоте реверсий под действием ICR-191 у ICR-индуцированных lac-мутантов Escherichia coli, несущих одновре­менно мутации uvrA, uvrB, recА и recВ. В этих опытах также было показано, что мутации, вызывающие нарушения в системе рекомбинаци­онной репарации, не оказывали влияния на ICR-индуцированный мута­генез; uvr-мутации, блокирующие первые этапы в системе восстановле­ния — выщепления — ресинтеза, резко повышали чувствительность к мутагенному действию ICR-191. Сравнение наших экспериментальных данных с литературными позволило прийти к заключению, что для осу­ществления АИ-индуцированного мутагенеза не требуется интактных ре­комбинационных систем. Мутации же, блокирующие первые этапы в си­стеме выщепления — ресинтеза, как у про-, так и у эукариот, приводят к потере способности удалять включившиеся в ДНК молекулы акридин-ипритов, что и служит причиной возникновения frameshift-мутаций в последующей репликации ДНК. Этим же можно объяснить высокую чувствительность штамма uvs1 к летальному действию АИ. Пока трудно дать какое-либо объяснение почти такой же высокой чувствительности к действию АИ штамма xrs2. Вероятно, летальные повреждения, вызы­ваемые АИ, могут исправляться и в процессе рекомбинационной репа­рации. Возможное различие в нарушениях рекомбинационного процесса у штаммов xrs1 и xrs2 приводит к разной чувствительности этих штам­мов к действию АИ.

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работах по изучению мутагенного действия акридин-ипритов на бактериях достаточно убедительно (генетическими, а в некоторых слу­чаях и биохимическими методами) показано, что эти вещества специ­фично индуцируют мутации «сдвига считывания». Таких однозначных результатов пока не получено на эукариотических организмах. Тем не менее подавляющее большинство работ, проведенных на грибах Neuro­spora crassa и Saccharomyces cerevisiae, свидетельствуют в пользу высокой специфичности мутагенного действия акридин-ипритов. Необхо­димо также отметить, что акридин-иприты для эукариот являются уни­кальными мутагенами, индуцирующими в основном только frameshift-мутации, которые не могут быть получены в массе при действии каких-либо других мутагенов.

Высокая мутагенная специфичность делает перспективным исполь­зование акридин-ипритов наряду с мутагенами, индуцирующими только замены пар оснований ДНК, для выяснения природы мутаций как спонтанных, так и индуцированных различными мутагенными факторами. Поскольку такие высокоспецифичные мутагены, индуцирующие замены пар оснований, как 2-аминопурнн, обычно используемые в опытах с бактериями, являются не активными по отношению к эукариотам, особый интерес приобретают данные, полученные Симаровым и Хромовым-Борисовым, о высокой специфичности мутагенного действия 6-гидроксиломинопурина. Система из двух мутагенных факторов: акридин-иприта, индуцирующего только frameshift-мутации, и 6-гидроксиламинопурина, индуци­рующего только замены пар оснований, может оказаться исключитель­но удобной для выявления природы мутаций у эукариот.

Необходимо отметить и высокую специфичность акридин-ипритов как люминесцентных красителей для хромосом, выявляющих их про­дольную дифференциацию, благодаря чему они получили широкое при­менение в цитологических исследованиях.

 

 

НОВЫЕ ДАННЫЕ О СТРУКТУРЕ И ФУНКЦИИ ГЕНОВ rII БАКТЕРИОФАГА Т4В

Г. Ф. НЕСТЕРОВА

Структура и функция различных организмов является результатом действия и взаимодействия генов. Именно поэтому изучение гена стало центральной проблемой молекулярной биологии наших дней. В послед­ние два десятилетия изучение строения и конкретных условий функцио­нирования отдельных генов вылилось в самостоятельное направление. Благодаря установлению генетической роли ДНК и РНК, с одной сто­роны, и контроля генов над синтезом ферментов — с другой, был выяс­нен основной путь реализации генетической информации: от ДНК через РНК к белку. Ответить на вопрос, как происходит реализация генетиче­ской информации в живой природе на различных уровнях ее организа­ции, помогают исследования, которые проводятся на многочисленных си­стемах «ген — фермент» или генетических системах, созданных в по­следние годы на основании изучения строения и действия отдельных генов. Понятие «генетическая система» означает ген, структура которо­го детально изучена с помощью прямых и обратных мутаций. Белковый продукт, синтезируемый этим геном, должен быть изучен настолько, что­бы можно было сопоставлять изменения гена с изменениями белка. Вся последовательность событий от обработки мутагеном до проявления му­таций должна быть также хорошо известна. Требования, предъявляе­мые к генетической системе, были в достаточно полном виде сформули­рованы Вестергаардом (Westergaard, 1959). Система, удовлетворяющая этим требованиям, может быть удобной моделью для изучения законо­мерностей возникновения мутаций, условий их проявления в виде изме­нения функций соответствующего белка и подробного исследования всех уровней «работы» гена.

Система генов rII бактериофага Т4 к настоящему времени остается одной из наиболее детально разработанных генетических систем. Это излюбленный модельный объект молекулярной биологии, на котором была впервые исследована тонкая структура гена, общие закономерно­сти химического мутагенеза, механизм рекомбинации. Структура генов, входящих в состав этой системы, изучена настолько подробно, что све­дения о ней до сих пор остаются уникальными по своей детальности.

К сожалению, данные об изменении генов, входящих в состав систе­мы rII, до последнего времени нельзя было сопоставить с данными об изменении состава соответствующих белков, поскольку белковые про­дукты, контролируемые этими генами, не были выделены. Лишь совсем недавно появились сообщения о выделении белков, контролируемых ге­нами rII (McClain, Champe, 1970; Щербаков и др., 1970; Ennis, Kievitt, 1973; Peterson et al., 1973). Тем не менее, в течение последних трех лет были достигнуты большие успехи в изучении отдельных этапов реали­зации генетической информации в системе rII: транскрипции, трансля­ции и взаимодействия белков rII на уровне четвертичной структуры.

Настоящий обзор имеет целью суммирование работ, проведенных в этом направлении.

Структура генов rII. Мутанты rII отличаются от фага дикого типа тем, что на Е. coli В (сокращенно — штамм В) образуют крупные прозрачные негативные колонии, а на штамме Е. coli К12 (λ) (сокращенно — штамм К) не образуют негативных колоний.

Неспособность мутантов rII расти на К позволяет их быстро отби­рать и повышает эффективность отбора рекомбинантов при скрещива­нии различных мутантов rII, поскольку при посеве на штамм К можно выявить и учесть самое незначительное количество возникающих реком­бинантов дикого типа.

Отсутствие роста на К у мутантов rII свидетельствует о том, что у них утрачена способность выполнять какую-то необходимую для роста на К функцию. Генетическая структура, которая контролирует эту функцию фага, была исследована на молекулярном уровне при исполь­зовании только качественных тестов. С помощью функционального тес­та на аллелизм было установлено, что она представляет собой два гена, контролирующие различные функции. Это позволило распределить все выделенные мутанты rII на две группы: мутанты, у которых мутацион­ные изменения локализованы в гене А, и мутанты, у которых они лока­лизованы в гене В. В дальнейшем производят локализацию мутаций rII в пределах генов А и В (Benzer, 1961).

Относительную длину генов А и В (Benzer, 1961) в области rII мож­но определить по частоте рекомбинаций, возникающих между двумя наиболее удаленными друг от друга мутациями этих генов. Оказалось, что длина гена А равна 13 ед. рекомбинации, а гена В — 7 ед. рекомби­нации. Измерение длины генов rII А и rII В по числу мутационных то­чек (сайтов), в каждой из которых произошло по одной и более мута­ций, дало то же отношение: в гене А оказалось 200 сайтов, в гене В — 108.

Расчеты показали, что если новые мутационные точки будут обнару­жены с той же частотой, то останется выявить еще 120 сайтов. Следова­тельно, общее количество сайтов, которое может быть обнаружено в пределах области rII, считают равным 428.

Истинные размеры области rII были определены в работе Буйяра с сотрудниками (Bujard et al., 1970) при электронной микроскопии ге­теродуплексных молекул ДНК из охлажденных смесей, содержащих де­натурированную ДНК одного из делеционных мутантов rII и денатури­рованную ДНК мутанта с крупной делецией Д; между генами 39 и 56.

Топография области rII, т. е. вопрос о том, все ли участки гена яв­ляются в одинаковой степени мутабильными и все ли связи внутри гена рвутся одинаково легко, изучен весьма подробно. В некоторых сайтах была обнаружена только одна мутация, в других — значительное коли­чество мутаций. Из 1612 спонтанных мутаций, картированных в 251 сай­те, более 500 возникло в «горячей точке» гена В и около 300 — в «горячей точке» гена А.

Оргел и Бреннер (Orgel, Brenner, 1961) показали, что спонтанные мутации в области rII в подавляющем большинстве своем относятся к классу frameshift (ревертирующих под действием акридинов). Вопрос о происхождении высокомутабильных сайтов спонтанного мутагенеза был исследован Штрайзингером (Streisinger et al., 1966) на модели гена «е» бактериофага Т4Д. Спонтанная мутационная «горячая точка» этого гена соответствовала участку цепи ДНК, состоящему из 6 идентичных осно­ваний. Штрайзингер предположил, что высокая мутабильность «горячих точек» вызвана частым неправильным спариванием в областях с повто­ряющимися основаниями. Частота возникающих при этом мутаций fra­meshift зависит от порядка оснований в данном сайте и будет тем выше, чем длиннее цепочка идентичных оснований ввиду повышения вероят­ности ошибочного спаривания. Это предположение нашло подтвержде­ние в недавних исследованиях Окада и сотрудников, проведенных на аналогичном экспериментальном материале (Okada et. al., 1972). Та же ситуация справедлива, по-видимому, для высокомутабильных «горячих точек» А6с и В4, локализованных в области rII бактериофага Т4В.

Наряду с «горячими точками» в этой области имеются значительные участки, где не обнаружено ни одной мутации. Достаточно упомянуть, что свыше 1/4 начальной части гена В не содержит мутационных точек. Генетические данные показывают, что число сайтов rII, способных к мутации путем замены пар оснований (транзиций), равно 1700 (Edgar et al., 1962; Stahl et al., 1964). Эти вычисления подкрепляются исследо­ваниями рекомбинации в пределах области rII с использованием изолированной ДНК бактериофага Т4 (Goldberg, 1966). До сих пор было идентифицировано менее 3% этих потенциальных сайтов. Возможны причины существования «немутабильных» сайтов:

  • многие сайты обладают низкой мутабильностью;
  • многие замены аминокислот не обнаруживаются в стандартных системах из-за того, что они мало изменяют функцию белка.

Первая возможность подкрепляется тем, что мутации амбер и охр, которые обнаруживаются с одинаково высокой эффективностью при му­тагенезе под действием гидроксиламина, проявляются с весьма разной частотой в различных сайтах. В пользу второй возможности свидетельствует необычно большой процент амбер-мутантов rII, возникающих путем замены пар оснований. Можно полагать, что значительная часть замен пар оснований, приводящих к возникновению миссенс-мутаций, попросту не обнаруживается (Benzer, Champe, 1961; Champe, Benzer, 1962). Весьма важно также то, что продукт rII, по всей видимости, про­изводится с избытком, поскольку многие мутанты охра rII хорошо супрессируются при эффективности размножения бактериофага ниже 10% (Brener, Beckwith, 1965).

Кох и Дрейк (Koch, Drake, 1970) разработали способ обнаружения новых мутационных точек в генах rII путем повышения эффективности  идентификации мутантов с неполным блоком функции. По данным этих авторов, около 1/10 мутантов rII, индуцированных азотистой кислотой на фоне мутации с неполным блоком функции (той же области), содержат вторую мутацию, также весьма слабо изменяющую функцию (криптическую мутацию). Криптическая мутация специфически взаимодейст­вует с исходной (сенсибилизирующей) мутацией, что приводит к полно­му блоку функции. Криптические мутации обычно картируются по соседству с сенсибилизирующими мутациями, однако в гене В существуют криптические мутации для сенсибилизирующих мутаций гена А. Криптические мутации располагаются сгустками. Преобладают те же горя­чие точки, что и у обычных транзиционных мутантов. Подавляющая часть криптических мутаций — ранее не обнаруженные сайты траизиций, которые, по всей видимости, не были зарегистрированы как мутационное изменение из-за пластичности состава соответствующего полипептида (Koch, Drake, 1970). Некоторые участки области rII, в которых мутационные сайты не выявляются, несут регуляторную функцию. Так, например, начальная часть гена В, в которой до сих пор не было обнаружено мутационных точек rII (мутантов с обычным фенотипом), содержит участок X, определяющий конфигурацию соответствующей иРНК, необходимую для ее взаимодействия с рибосомами и инициации синтеза полипептида rII B (Sarabhai, Lamfrom, 1970). Мутант X, инду­цированный аналогами оснований, обладал свойствами, резко отличавшими его от прочих мутантов rII.

Исследования, демонстрирующие разницу спектров мутаций rII, индуцированных различными по характеру действия мутагенами, доста­точно широко известны (Krieg, 1963; Drake, McGuire, 1967; Drake, 1970).

Справа от области rII, на расстоянии, равном 10 ед. рекомбинации, располагается ген «ас», контролирующий резистентность вегетативного фага к акридиновым красителям. Область между геном В и геном «ас», по-видимому, состоит из трех генов, причем центральная часть ее также контролирует чувствительность к акридину. Функция ее не обязательна для развития на различных штаммах Е. coli (Bautz, Bautz, 1967; Dove, 1968). В этой области, по-видимому, локализован структурный ген эндо­нуклеазы IV, контролируемой фагом (Sadowski, Vetter, 1-973; Vetter, Sadowski, 1974).

Слева от генов rII вплоть до гена 60 простирается область, которая долгое время не была картирована мутациями, выявляющими ее функ­цию. Вероятно, функция этой области родственна функции области rII и несущественна для роста Т4В в Е. coli В. Доказательством этому слу­жат недавно выделенные и локализованные в пределах этой области мутации, по фенотипу аналогичные мутациям rII ts (Нестерова, Запад­ная, 1972).

В популяции фаговых частиц встречаются очень редкие частицы, ко­торые содержат не одну, а две копии области rII и при дальнейшем размножении сохраняют эту особенность. Обычно такие частицы выде­ляют как жизнеспособное потомство от скрещивания двух штаммов с перекрывающимися делециями области rII. При размножении каждой из полученных негативных колоний в отдельности получают «диплоид­ные» штаммы с дупликацией области rII (Parma, Ingraham, 1970).

Генетический анализ 10 штаммов бактериофага Т4Д с дупликацией области rII, выделенных при скрещивании делеционных мутантов rJ 101 и r 1589, показал, что в популяции этих штаммов содержатся фаговые частицы с нормальными хромосомами (сегреганты) и частицы с тремя копиями области rII (сегреганты с трипликацией). У девяти штаммов область rII, ведущая свое происхождение от родительского штамма делецией r 1589, была расположена слева от области rII с rJ 101; у одного штамма порядок локализации областей rII был обрат­ным.

На основании этих наблюдении была выдвинута гипотеза, согласно которой удвоение области rII у исследованных штаммов является результатом тандемной дупликации (Parma et. al., 1972).

В опытах по спасению маркера после УФ-облучения штаммов с дупликацией области rII было показано, что наклон кривых спасения маркера rII у исследуемых штаммов соответствует ожидаемому при близком расположении двух областей rII в одной фаговой хромосоме (Мат­виенко, 1972). Это наблюдение является независимым указанием на то, что дуплицированные гены rII расположены тандемом, а не на концах хромосомы.

Свойства штаммов, содержащих тандемную дупликацию, были де­тально изучены Саймондсом с соавторами (Symonds et al., 1972).

При скрещивании мутантов с делецией rII 1589 и с перекрывающей ее делецией rII 638 возникают отдельные фаговые частицы, которые со­держат две копии области rII, по одной от каждого родительского штамма. Эти частицы были названы частицами rII М4. Для объяснения свойств rII М4 была предложена модель, согласно которой при спаривании негомологичных участков фагового генома между ними происхо­дит одиночный кроссинговер. Один из продуктов такой необычной ре­комбинации представляет собой тандемную дупликацию, длина которой и местонахождение в геноме фага полностью зависят от позиции спари­вающихся сегментов генома. «Диплоиды» rII М4 содержат, таким образом, тандемную дупликацию. Дуплицируется участок генома, гораздо больший по своим размерам, чем область rII. Этот участок должен включать области, расположенные справа и слева от генов rII. При дальнейшем размножении частиц rII М4 может произойти рекомбинация между гомологичными сайтами дуплицированных участков (Symonds et al., 1972; Parma, Snyder, 1973).

Исходя из этой модели, можно было предсказать ряд свойств rII М4, которые до сих пор не были изучены: частоту сегрегации родительских генотипов, долю частиц с генотипом того или другого родительского штамма среди сегрегантов, относительную протяженность терминальной избыточности и новые типы «диплоидов», которые могут возникнуть из rII М4. Дальнейшие исследования показали, что «диплоиды» rII М4 действительно обладают этими предполагаемыми свойствами.

Частота сегрегации частиц rII 1589 и rII 638 в популяции rII М4 оказалась прямо пропорциональной общей длине области дупликации. Отношение фаговых частиц rII 1589 и rII 638 среди этих сегрегантов за­висело от ориентации двух областей rII и от относительной длины гомологических областей в дуплицированном участке генома. У большин­ства штаммов М4 отношение сегрегации rII 1589 к rII 638 было равно 1:2. Это означало, что в участке дупликации слева располагается область rII с делецией 1589. Длина терминальной избыточности у rII М4 меньше, чем у фага дикого типа.

В результате случайной рекомбинации при размножении rII М4 дол­жны формироваться гомозиготные «диплоиды», содержащие две копии области rII с делецией rII 1589 или области rII с делецией rII 638. Та­кие фаговые частицы были действительно обнаружены среди частиц rII М4 с частотой 10-3. Гомозиготные «диплоиды», в свою очередь, ока­зались родоначальниками целой серии новых «диплоидных» штаммов, у которых концевые точки дуплицируемой области были одинаковыми, но одна из исходных делений была заменена другой мутацией rII. Та­кой диплоид можно получить, например, при скрещивании гомозиготного диплоида 1589/1589 с делеционным мутантом rII 196 (Symonds et al., 1971). Особенности «диплоидов» rII, полученных при скрещивании других делеционных штаммов, во многом совпадали с описанными выше.

Были разработаны методы картирования концевых точек тандемных дупликаций области rII с использованием точковых мутаций или крупных делеций, локализованных справа или слева от дупликации (Parma, Snyder, 1973). С помощью этих методов удалось показать, что точек дупликации и, следовательно, длина дуплицированного участка хромосомы различны у независимо полученных штаммов. Как правило, область дупликации охватывала от двух до пяти генов. У многих штаммов были дуплицированы не только область rII, но и соседние с ней участки генетического материала. У большин­ства «диплоидов» в состав дупликации была включена лишь часть об­ласти rII. Описаны делеции, наличие которых в генетическом материа­ле «диплоидов» стабилизирует структуру гетерозиготных участков, уменьшая возможность рекомбинации между ними. Одна из таких де­лений (sd1) локализована в правой части области дупликации, другая (sd2), находится слева от области rII (Van de Vate et al., 1974). Меха­низм формирования фаговых хромосом с гомозиготными и гетерозиготными тандемными дупликациями отдельных участков, а также возмож­ность получения хромосомы с трипликациями тех же участков служат примером одного из вероятных способов образования следующих друг за другом повторов генетического материала, встречающихся у прокариот и широко распространенных у эукариот.

Транскрипция. Согласно многочисленным генетическим и физико­химическим данным, область rII транскрибируется с L-цепи ДНК со 1—4-й минуты инфекции (Kasai et al., 1968; Crick et al., 1961; Schmidt et al., 1970). Транскрипция продолжается в течение всего латентного периода, одновременно с транскрипцией «поздних» генов. Максимум транскрипции приходится на 4—6-ю минуты инфекции (Bujard et al., 1970). Направление транскрипции по генетической карте — от гена А к гену В. Оно, как и у прочих «ранних» генов фага Т4, противоположно направлению репликации, в то время как поздние гены ориентированы в направлении репликации. Транскрипция области rII может происходить только при наличии предварительного синтеза белка. При блокаде синтеза белка хлорамфениколом транскрибируются только «пре-ранние» гены, и синтезируется только один класс иРНК, который получил наз­вание «непосредственно ранняя» РНК. Транскрипция собственно «ран­них» генов обычно начинается позднее. При этом образуется второй класс иРНК — «ранняя с задержкой» РНК. В ее состав входит иРНК области rII. Возможно, что транскрипция «ранних» генов происходит при участии особого фактора, «антитерминатора», способствующего продолжению транскрипции от «пре-ранних» генов к «ранним».

Этот фактор, по-видимому, не синтезируется в присутствии хлорамфеникола. Помимо антитерминатора, существуют другие системы кон­троля транскрипции «ранних» генов. Транскрипция гена А, вероятно, находится под контролем «раннего» промотора, локализованного около левого конца гена. Транскрипция гена В начинается еще до того, когда РНК-полимераза, специфичная для гена А, синтезирует начальную по­ловину иРНК гена А.

Исследования показали, что у гена В имеется свой промотор, и транс­крипция этого гена может происходить независимо от транскрипции гена А. Этот промотор локализован между генами А и В. По данным Витмера (Witmer, 1971), in vivo только 30% иРНК, синтезирующихся в этой области генома, — полицистронные. Длина полицистронных иРНК не превышает 7100 нуклеотидов. Они транскрибируют всю область rII вместе с дистальной областью Д12. По всей видимости, вблизи промотора гена В процесс транскрипции терминируется не всегда (Schmidt et al., 1970). Скорость транскрипции можно вычислить по вре­мени появления отдельных сегментов иРНК гена А. Она оказалась ной 34±8 нуклеотидам/сек, поскольку весь ген А транскрибировался за 60±10 сек (Schmidt et al., 1970). На один фаговый геном каждые 2 минуты синтезируется 13 молекул иРНК, специфичных для области rII, 15 молекул РНК-полимеразы транскрибируют область rII одновременно, начиная новую цепь иРНК каждые 6 секунд (Bujard et al., 1970). При 18° ген А транскрибируется в пределах 11—18 мин, а ген В — в пределах 18—23 мин. после начала инфекционного цикла

Трансляция. Особенности трансляции области rII изучены еще статочно. Сарабхай и Лэмфром (1970) показали, что свободные рибосомы могут непосредственно инициировать синтез белка в месте внут­ренней инициирующей последовательности оснований иРНК, специфич­ной для гена В. Инициирующая последовательность оснований имеет, по-видимому, специфическую структуру, благодаря которой она дейст­вует как точка распознавания, где могут прикрепляться свободные рибосомы. Она выполняет роль точки распознавания в том случае, если рядом локализован терминирующий триплет или протяженная делеция.

Интенсивность трансляции генов А и В, по всей видимости, регули­руется определенной последовательностью оснований, расположенной в начале каждого из генов. Не исключено, что такой последовательностью оснований являются сами промоторы А и В. Экспериментальные дан­ные, на основании которых сделан этот вывод, подробно изложены в разделе «Белок rII».

Шварц и Брисон (Schwartz, Bryson, 1970) обнаружили, что под влиянием стрептомицина фенотип некоторых мутантов rII меняется. Мутанты приобретают способность расти на К-12 (λ). Это явление полу­чило название «фенотипическая супрессия». Стрептомицин изменяет процесс считывания иРНК в рибосомах таким образом, что У читается как Ц и в меньшей степени как А. Это может привести к супрессии нон­сенс-мутантов трех известных типов:

стрептомицин

 

УАЦ (амбер) ————————————————> ЦАЦ (глутамин) или ААЦ (лизин)

УАА (охра) ————————————————> ЦАА (глутамин) или ААА (лизин)

УЦА (опал) ————————————————> ЦЦА (аргинин) или АЦА (аргинин).

Активность синтезируемого белка при этом зависит от приемлемости замен в данной мутационной точке. Для получения приемлемых замен нонсенс-мутанты индуцировали гидроксиламином in vitro. В этих усло­виях гидроксиламин вызывает замены ГЦ->-АТ. При этом мутации ам­бер и охра могут возникать из глутаминовых кодонов:

гидроксиламин

ЦАА——> УАА

ЦАЦ——> УАЦ,

а мутации опал — из аргининового кодона: УЦА гидроксиламин ЦЦА.

В нуклеотидах, соседствующих с триптофановым кодоном УГГ, могут появляться пары тесно сцепленных мутаций амбер — опал. У мутантов амбер, охра и опал действие стрептомицина может привести к синтезу белка дикого типа. У мутантов амбер — опал белок дикого типа не восстанавливается и супрессия может оказаться мало эффективной. Эта схема индукции нонсенс-мутаций и их супрессии была проверена для нонсенс-мутантов гена А, картированных в различных его участках. Наиболее активной была супрессия мутантов амбер и в меньшей степени — мутантов охра и опал. Супрессия пар амбер — опал зависела от их положения на карте гена. Она была сравнительно высокой у мутан­тов в начальной части гена и низкой у мутантов в конце гена. Та же за­висимость наблюдалась у мутантов опал. Эта зависимость может отра­жать конкуренцию между чтением нонсенс-кодона под действием стрептомицина и общим резким снижением синтеза белка под действием того же препарата.

Белок rII. Белки, контролируемые генами А и В, были обнаружены в 1973 г., через 20 лет после первых работ Бензера, посвященных исследованию тонкой генетической структуры области rII, и до сих пор еще не выделены в количествах, необходимых для анализа. Попытки выделить белковый продукт, кодируемый областью rII, были сопряжены с рядом затруднений, основной причиной которых было отсутствие удобного функционального контроля. Наиболее приемлемым путем для исследований такого рода было разделение хроматографическим методом всей суммы белков, присутствующих в бактериальных клетках, зара­женных фагом r+, и сравнение полученных хроматограмм с хромато­граммами клеток, зараженных делеционным мутантом rII.

Щербаков и соавторы (1970) исследовали синтез белков в клетках Е. coli В, зараженных фагом Т4Br+ и делеционным мутантом 1272, у ко­торого полностью отсутствовала область rII. Исследование велось ме­тодом электрофореза в градиенте концентрации полиакриламидного геля. Среди ранних белков, индуцируемых фагом дикого типа, была об­наружена фракция, отсутствующая среди соответствующих белков делеционного мутанта.

Мак-Клайн и Чеймп (McClain, Champe, 1970) обнаружили фрагмен­ты полипептида, кодируемого геном В, применив триптическое перева­ривание белков зараженных клеток Е. coli В. Авторы воспользовались меньшей растворимостью полученных таким способом компонентов полипептида В, по сравнению с компонентами полипептида А. После многостадийной очистки была получена полипептидная фракция, 20% которой составляли компоненты полипептида В. При изучении этой фракции оказалось возможным идентифицировать некоторые мутационные изменения в полипептиде В. Таким образом, было найдено прямое подтверждение тому, что полученный продукт кодируется геном В.

На основании локализации тесно сцепленных пар мутаций амбер — опал (Brenner et al., 1967) и локализации мутаций амбер, индуцированных гидроксцламином без последующей репликации, было показано, что в гене В имеются три триптофановых кодона. Два кодона кодируют триптофан, входящий в состав компонента 30 исследованной полипептидной фракции. Компонент 30, по всей видимости, соответствует среднему участку полипептида В. Первые два способа идентификации этого полипептида базировались на том, что спонтанная реверсия мутаций амбер и охра, возникших в месте триптофановых ко­донов, чаще всего происходит путем образования глутаминовых и аргининовых кодонов. У 7 из 9 спонтанных ревертантов rHВ 232 (мутации в одном из триптофановых сайтов средней части гена В) не было обнаружено метки по триптофану, которой метили компонент 30.

В полипептидной фракции, выделенной при заражении клеток му­тантом опал rХ655 (начальная часть гена В) или спонтанным ревертантом rХ655, не было обнаружено метки по триптофану, соответству­ющей начальной части полипептида В.

Третьим способом идентификации полипептидов rIIВ было получе­ние дополнительных триптофановых кодонов в гене В и обнаружение новообразованных остатков триптофана в компонентах полипептидной фракции. Из мутанта охра можно получить новый триптофановый ко­дон, выделив амбер и опал-производные (аллели) этого мутанта и скре­стив их между собой. Результатом такого скрещивания будут два клас­са рекомбинантов: исходный охра (УАА) и класс с дополнительным триптофановым кодоном (УГГ). У нескольких рекомбинантов, получен­ных таким способом, был обнаружен новый остаток триптофана в соот­ветствующем компоненте полипептидной фракции.

В дальнейшем белковые продукты генов А и В были идентифициро­ваны Эннисом с соавторами (Peterson et al., 1973; Ennis, Kievitt, 1973), изучавшими состав оболочки зараженных клеток с помощью электро­фореза ее различных фракций в полиакриламидном геле. Сравнение со­става внутренней и внешней мембран оболочки у зараженных и незараженных клеток показало, что инфекция бактериофагом Т4 приводит к резкому изменению процессов синтеза бактериальной оболочки. Синтез основного белка внешней мембраны (м. в. 58 000 дальтон) полностью прекращается. Этот белок, вероятно, замещается в функциональном от­ношении тремя новыми белками, синтез которых индуцирован фагом. Новые белки входят в состав внутренней мембраны и могут быть обна­ружены спустя 1—5 мин. после заражения. Их молекулярный вес равен 22000, 29000 и 37 000 дальтон. При заражении бактериальных клеток мутантом rII 638, содержащим делецию, которая распространяется на весь ген rIIВ, белок с м. в. 37 000 не синтезируется.

Синтез основного белка внешней мембраны замедлен по сравнению с таковым у незараженных бактерий, но не прекращен.

Таким образом, белковым продуктом гена rIIВ. является полипеп­тид с молекулярным весом 37 000, ассоциирующимся в процессе инфек­ции с внутренней мембраной оболочки бактерии-хозяина (Peterson et al., 1973).

Заражение бактерий мутантом rII Н88 с делецией большей части гена А не приводило к заметному изменению синтеза трех белков вну­тренней мембраны, индуцированных фагом. Синтез основного белка внешней мембраны продолжался так же, как и при заражении мутан­том с утраченным геном В, хотя и был в значительной мере снижен.

Белковый продукт гена А также оказался связанным с оболочкой зараженной клетки. Суммарная фракция мембран зараженных клеток, выделенная по методу Кэбэк (Kaback, 1971), была исследована элек­трофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом. В мембра­нах, выделенных из клеток, инифицированных Т4r+, был обнаружен бе­лок с приблизительным молекулярным весом 74 000. В мембранах клеток, зараженных мутантом rII Н88, этот белок отсутствовал. В той же суммарной фракции мембран был обнаружен белок rIIВ, идентифици­рованный согласно представленным выше характеристикам (Ennis, Kie­vitt, 1973).

При заражении бактериальных клеток различными амбер-мутантами rII А вместо белка с молекулярным весом 74 000 были обнаружены пептиды меньшего размера. Было обнаружено колинеарное соответствие между молекулярным весом пептида и локализацией мутации (рис, Молекулярный вес пептидов в каждом случае совпадал с теоретиче­ским, который можно было вычислить на основании локализации дан­ной мутации. Заражение мутантом rII А105 (деления дистальных 20% гена А) приводило к синтезу пептида, действительный молекулярный вес которого был равен 62 000, а предполагаемый 57 700. При заражении амбер-мутантом НВ 35, у которого мутация локализова­на в том же сегменте, что и проксимальная граница делеции А 105, дей­ствительный молекулярный вес пептида был равен 66000, а предпола­гаемый 60 700. При 36° синтез белка rIIA начинается через 4—8 мин. после заражения и продолжается в течение последующих 15—20 мин.

Количество белка rIIA, присутствующего в мембранах, составляла лишь 10—25% от общего количества белка rIIВ. Это наблюдение не совпадает с результатами опытов по транскрипции, показывающими, что гены А и В имеют общий Механизм регуляции транскрипции и транскрибируются одинаково (Sederoff et al., 1971). Различное содержание белков rIIA и rIIВ в оболочке нельзя объяснить тем, что часть белка rIIA не связана с мембранами, поскольку в суммарном экстракте за­раженных клеток доля белка В также выше. Эти данные полностью соответствуют результатам исследования Мак-Клейна и Чемп (McClain, Champe, 1970), которые выделили из аналогичных экстрактов пептид rIIВ, но не смогли обнаружить ни одного пептида, входящего в состав белка rIIA. Возможно, что различная интенсивность синтеза белков А и В обусловлена специфическим контролем трансляции гена А. Данные о синтезе белка rII у мутанта rII 1589 подтверждают это предположе­ние. У мутанта утрачены дистальная часть гена А, проксимальная — ге­на В и сигнал терминации, разграничивающий эти гены. Функция гена А нарушена, но ген В, несмотря на делецию начального сегмента, кон­тролирует синтез активного белка. В суммарной фракции мембран бактериальных клеток, зараженных этим мутантом, был обнаружен белок с молекулярным весом, равным предполагаемому весу белка-компаунда, продуцируемого уцелевшими участками области rII. Весьма важно отметить, что количество этого белка было равно количеству белка А, которое синтезируется при заражении бактериальных клеток фагом ди­кого типа. Таким образом, у мутанта rII 1589 трансляция белка, функ­ционирующего как продукт гена В, находится под контролем, специфич­ным для гена А.

Эти данные можно рассматривать как указание на то, что транс­ляция может в значительной мере регулироваться проксимальным уча­стком гена. Не исключено, что роль регулятора трансляции принадле­жит промотору гена А. Дальнейшие исследования, по-видимому, помо­гут установить, выполняет ли эту функцию промотор или она свойст­венна какой-либо иной последовательности оснований в начале гена или перед ним.

Идентификация белков, контролируемых областью rII, показала, что вопреки распространенным ранее представлениям (Koch, Drake,  1970) они не объединяются в гетеромультимер, представляющий собой суммарный продукт области rII. Более того, они взаимодействуют с разными компонентами бактериальной оболочки. Многочисленные гене­тические исследования указывают на возможную структуру и взаимо­действие белков А и В.

Обнаружение межаллельной комплементации в гене А (Финчем, 1968) свидетельствует о том, что белок, контролируемый геном А, яв­ляется мультимером. Межаллельная комплементация в гене В не была обнаружена, несмотря на значительные усилия, затраченные в этом направлении (Koch, Drake, 1970). Высокий процент ts-мутаций в гене А по сравнению с их содержанием в гене В, возможно, также является отражением сложной структуры полипептида А (Нестерова, Западная, 1972). С дру­гой стороны, относительно малая доля ts-мутаций, локализованных в гене В, может отражать сравнительную конформационную стабильность полипептида В. Полипептиды А и В, по-видимому, все же каким-то об­разом взаимодействуют друг с другом. Об этом свидетельствует функ­циональный синергизм мутационных повреждений генов А и В. Воз­можно, что это взаимодействие опосредовано какими-либо структурными компонентами мембран, как это имеет место при взаимодействии генов rII с продуктами генов, контролирующих репликацию фаговой ДНК. Наличие криптических мутаций в гене В для сенсибилизирующих мутаций гена А, наряду с отсутствием супрессии мутаций гена А мута­циями гена В, показывает сложность взаимодействия полипептидов А и В на уровне четвертичной структуры (Koch, Drake, 1970). Примером такого взаимодействия может служить совместное подавление белками А и В синтеза основного белка внешней мембраны, продуцируемого бактерией-хозяином. При функционировании обоих продуктов области rII синтез этого белка полностью прекращается; у мутантов с нарушенной функцией А или В его синтез снижен, но не прекращен (Ennis, Kievitt, 1973).

Существование двух «горячих точек» ts-мутаций в начале и в конце может указывать на наличие двух участков в начале и конце полипептидной цепи А, ответственных за конформацию всей молекулы белкового продукта А (Нестерова, Западная, 1972).

Сравнение времени синтеза и времени функции белкового продукта гена А в опытах со сдвигом температур выращивания мутантов rIIts показало, что он функционирует немедленно после синтеза в течение первых пяти минут инфекции (Нестерова, Западная, 1970).

На ранних стадиях роста мутантов rII в Е. coli К12 (X) основные процессы инфекции протекают нормально. Однако через 12 мин. после заражения, незадолго до появления первых внутриклеточных фаговых частиц, синтез белка и ДНК приостанавливается и значительно снижа­ется уровень дыхательных процессов. Вероятно, дефект функции генов rII проявляется в том механизме, который является основным для об­щего метаболизма клетки. Было установлено, что инфекция К12 Я мутантами rII приводит к проявлению только ранних функций. Следовательно, гены rII имеют значение для выраже­ния поздней функции фага в клетках хозяина К.

Секигучи (Sekiguchi, 1966) высказал предположение, что основной причиной прекращения развития мутантов rII в Е. coli К12 (к) является нарушение окислительного фосфорилирования.

Это представление основывалось на том, что:

  • включение Р32 в АТФ и другие соединения, содержащие фосфор, резко снижается через 3 мин. после инфицирования бактерий мутанта­ми rII, в то время как поглощение клетками неорганического фосфора не изменяется;
  • количество АТФ в бактериях К12 Ш снижается после инфициро­вания их мутантами rII;
  • мечение уридина двумя изотопными метками показало, что в бак­териях К12 (λ), зараженных мутантами rII, прекращается фосфорилирование нуклеотидов и вследствие этого прерывается синтез нуклеино­вой кислоты;
  • снижение фосфорилирующей активности в клетках, инфицирован­ных мутантами rII, наблюдается непосредственно после заражения, в то время как другие процессы обмена продолжаются нормально при­близительно до 10-й минуты инфекционного цикла.

Перечисленные факты позволили автору сделать вывод о том, что прекращение метаболизма в клетках, инфицированных мутантами rII, вызывается истощением запасов АТФ.

В соответствии с данными многих исследователей (Garen, 1961; Fer­ro-Lucci Ames, Ames, 1965; Крылов, 1967; Buller, Astrachan, 1968) у бак­терий, зараженных мутантами rII, нарушена проницаемость клеточной мембраны. Таким образом, белковые продукты rII прямо или косвен­но способствуют стабилизации оболочки зараженных бактерий.

Суммируя вышесказанное, можно надеяться, что в ближайшем бу­дущем белки, контролируемые областью rII, будут выделены в количе­ствах, достаточных для анализа их структуры. Длительная работа по созданию генетической системы rII, которую проводят в настоящее вре­мя многие исследователи в различных странах, будет тем самым завершена. Круг исследований функции генов в организме значительно расширится, обогатившись теми возможностями, которые дает использование генетической системы rII.

Comments are closed.