ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

WwPhgMXcZRoСправочник по функциональной диагностике в педиатрии. Под редакцией проф.Ю.Е.Вельтищева, члена-корреспондента АМН СССР проф. Н.С.Кисляк. Москва. Медицина. 1979.

 

 

 

 

2Jou_aNSjJw-1-225x300Редактор страницы: Крючкова Оксана Александровна

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Цитогенетические методы используются в диагностике хромосомных болезней, которые, как правило, не передаются по наследству. Аномалии хромосом наступают спонтанно в гаметогенезе у родителей с нормальным хромосомным набором. Цитодиагностика находит свое применение в обнаружении аномалий хромосом у плода и, таким образом, является составной частью пренатальной диагностики. Классификация хромосом составлена на основе данных Парижской конференции.

Экспресс-диагностика аномалий половых хромосом

Определение полового хроматина. У индивидов женского пола с кариотипом 46,XX одна из Х-хромосом находится в инактивированном заспирализованном состоянии и располагается чаще всего на периферии интерфазного ядра. Цитологически она обнаруживается в виде полового хроматина, или так называемого тельца Барра.

Исследование полового хроматина проводят в мазках буккально­го эпителия, окрашенных 1%. ацетоорсеином (по Сандерсу), причем подсчитывают только тельца полового хроматина, расположенные на внутренней оболочке ядра эпителиальной клетки. В среднем частота хроматинположительных ядер в буккальном эпителии у здоровых лиц женского пола достигает 30%, а у здоровых лиц мужского пола половой хроматин практически отсутствует. Следует иметь в виду, что в первые 2  сут у новорожденных обнаруживается низкий уровень полового хро­матина, и лишь к 5—10-му дню жизни содержание его возрастает до нормы.

Половой хроматин выявляется также в виде «барабанных палочек» в сегментоядерных нейтрофилах (образования округлой формы диа­метром около 1,5 мкм, соединенные с ядром тонкой ножкой). Их можно обнаружить при помощи обычной гематологической окраски по Рома­новскому — Гимзе.

В мазках буккального эпителия у больных с синдромом Шерешевского — Тернера (кариотип 45, ХО) половой хроматин не обнаружива­ется. Напротив, у пациентов мужского пола с синдромом Клайнфелтера (кариотип 47 XXY) в клетках буккального эпителия обнаруживаются тельца Барра в различных количествах.

В клинических условиях определение полового хроматина широко ирименяется для диагностики аномалий набора половых хромосом.

Показанием к определению полового хроматина являются: аномалии половых органов, низкий рост у девочек, первичная аменорея, лимфоангиэктатический отек у новорожденных, евнухоидный высокий рост в сочетании с гипогонадизмом у мальчиков.

Флюоресцентный метод определения Y-хроматина основан на спо­собности люминесцентных красителей, в частности акрихина, избира­тельно окрашивать дистальные участки длинных плеч Y-хромосомы и при люминесцентной микроскопии давать яркое свечение. Флюорес­ценция Y-хромосомы выявляется в мазках буккального соскоба, в спер­матозоидах человека, в клетках амниотической жидкости, в лейкоцитах периферической крови. Этот метод позволяет выявлять анеуплоидии, а также некоторые структурные аномалии Y-хромосомы.

Среди субъектов мужского пола высокого роста с асоциальным по­ведением выявляются носители комплекса половых хромосом XYY. В интерфазных клетках таких пациентов обнаруживаются два ярко флюоресцирующих Y-тельца. У лиц со структурными перестройками длинного плеча Y-хромосомы наблюдаются либо увеличенные в размерах Y-тельца (при дупликациях), либо уменьшенные (при делециях).

Исследование кариотипа

Исследование хромосом в клетках костного мозга. Метод основан на изучении делящихся клеток костного мозга, полученного при стер­нальной пункции. Пунктат подвергают специальной обработке и окра­шивают ацетоорсеином или голубой по Унна. Для лучшего разделения хромосом используют разнообразные способы обработки препаратов (колхицин, гипотонический раствор хлорида калия, колцемид и др.).

Исследование хромосом в культуре тканей. Культивирова­ние клеток крови. В специально обработанные лимфоциты периферической крови добавляют фитогемагглютинин и антибиотики. Смесь культивируют в термостате в течение 72 ч. Для лучшего разделе­ния хромосом используют колхицин или его аналоги.

Культивирование кожи. В тех случаях, когда у боль­ного подозревают возможность мозаицизма, изучают кариотип не только в клетках крови, но и в других тканях, в частности в коже. Методика предполагает два этапа: на первом — получение первичной культуры на втором — размножение клеточной культуры.

Культивирование эмбриональных фибробластов. При исследовании хромосом эмбрионов используют одно­слойные культуры. Для разрушения межклеточных связей (дезагрега­ции) ткани подвергают механической или энзиматической обработке. Кашицу из тканей обрабатывают трипсином. Клеточную суспензию осаждают центрифугированием. Оптимальной концентрацией клеток для посева считается 200 ООО—300 ООО клеток на 1 мл питательной среды. При обнаружении клеток с хромосомными аберрациями принимают ме­ры к их сохранению (замораживание) для последующего их изучения.

В табл. 174 приведены симпотомы важнейших хромосомных анома­лий.

Показания к анализу хромосом. 1. Врожденные пороки развития в сочетании с умственной и физической отсталостью.

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Таблица 174 Симптоматология важнейших хромосомных аномалий

2.  Аномалии половых органов с явлениями умственной отсталости и без них, задержка роста (после предварительного исследования полового хроматина).

3.   Влияние физических и химических мутагенов на организм чело­века.

4.   Болезни крови: хроническая лейкемия, острый лейкоз, болезнь Вальденстрема, анемия Фанкони.

5.   Родители детей с болезнью Дауна (не старше 30 лет).

СКРИНИРУЮЩИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ НАСЛЕДСТВЕННЫХ АНОМАЛИЙ ОБМЕНА ВЕЩЕСТВ

Основное, значение придается ранней диагностике дефектов обмена у новорожденных. С этой целью рекомендуются микробиологические и биохимические методы исследования.

Микробиологические методы диагностики

Метод Гатри. Используется культура В. subtilis, рост которой подав­ляется добавлением в среду тех или иных ингибиторов: при фенилкетонурии -фенилаланина, при лейцинозе — 2-метиллейцина, при гистидинемии — азосерина и т. п. Тормозящее влияние ингибиторов па рост микробов устраняется внесением в кровь или мочу больных фенилкетонурией, гистидинемией или лейцинозом, содержащих повышенные концентрации фенилаланина, лейцина, гистидина или других амино­кислот. Содержание аминокислот в исследуемом материале определяется путем сравнения зон роста микроба со стандартным рядом. Микробио­логический тест Гатри нашел широкое использование в США, Канаде, Англии, ПНР, ГДР и других странах в основном для массового обсле­дования новорожденных на фенилкетонурию.

Метод с использованием ауксотрофных штаммов B.E.Coli К-12 основан на применении стрептомицинрезистентных штаммов Е. Coli К-12, ауксотрофных по 10 аминокислотам: аргинину, гистидину, лей­цину, лизину, метионину, пролину, тирозину, триптофану, фенилалани­ну и цистину, Преимуществом этого метода по сравнению с тестом

Гатри является отсутствие необходимости в добавлении дорогостоящих ингибиторов роста микробов. Метод основан на стимуляции роста аук­сотрофных мутантов минимальным количеством аминокислот, содер­жащихся в крови или моче. Кровь ребенка после прокола пятки или пальца каплями наносят на абсорбирующую фильтровальную бумагу в виде дисков размером не менее 10 мм. После подсыхания бланки с кап­лями крови могут храниться в эксикаторе при температуре 4°С или в целлофановом пакете в холодильнике для более длительного хранения. Накануне анализа дыроколом выбивают одинаковые диски, и помещают в отдельные пакетики, которые в последующем автоклавируют в течение 1 мин при температуре 120°С. В последующем кровяные диски помещают на поверхность газона индикаторной культуры. Планшеты оставляют на 24 ч в термостате при температуре 37°С. При измерении возникших зон роста выделяются те, размер которых превышает стандартные нормати­вы. Для выяснения природы выявленных расстройств в последующем применяют более точные биохимические методы. Метод получил распро­странение в СССР, используется при массовом и селективном скрининге.

Микробиологический тест определения галактоземии. Используется мутант В. Е. Coli, чувствительный к галактозе в связи с неспособностью синтезировать галактозо-1-фосфатуридилтрансферазу. Чувствительность штамма 30 мг%. На втором этапе исследования рекомендуется исполь­зование метода хроматографии углеводов, галактозо-1-фосфата или прямое, а также косвенное определение активности фермента. Метод ис­пользуется в СССР при селективном скрининге.

В последние годы получают развитие методы, основанные на непос­редственном определении активности ферментов. Флюорометрический тест определения активности галактозо-1-фосфат-уридил- траисферазы (на галактоземию) основан на реакции восстановления НАД или НАДФ, которые в восстановленной форме обладают сильной флюоресценцией. В последующем этот тест был использован для экспресс- определения глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, пируваткиназы, глутамат-дегидрогеназы и др. Этот метод и его модификации имеют следующие преимущества при использовании в массовом скрининге: активность энзимов определяется в капле крови, высушенной на фильтровальной бумаге: методами гелевого электрофореза может быть исследован спектр изоэнзимов в крови, полученной с бумажного диска.

Биохимические методы диагностики

Качественные пробы с мочой

При наследственных нарушениях обмена в моче могут появляться нехарактерные для здоровых детей химические вещества, нередко изменяя ее цвет, прозрачность и запах. Для выявления продуктов извра­щенного метаболизма используют набор химических реактивов, добав­ление которых в свежую мочу вызывает изменения ее окраски.

Тест на белок. Используют 20% раствор сульфосалициловой кисло­ты; появление помутнения указывает на протеинурию. Тест может быть положительным при наследственных заболеваниях почек, в том числе и при синдроме де Тони — Дебре — Фанкони, цистинозе, при галакто­земии и др.

Тест на ацетон. Используют 5% водный раствор нитропруссида натрия, ледяную уксусную кислоту и 10% раствор NaOH. В присут­ствии кетоновых тел моча окрашивается в красный цвет, несмотря на

добавление уксусной кислоты. Тест может быть использован в диагнос­тике сахарного диабета, гликогеноза I, III и IV типа и др.

Тест Миллона на тирозин и п-гидроксифенилпировиноградную кислоту. Используют реактив Миллона, который вступает в реакцию с фе­нольной группой тирозина и его производных с образованием красно- оранжевого цвета. Сравнение производят со стандартными растворами тирозина. Тест может быть использован в диагностике тирозиноза, болезни Гартнепа, цистиноза и др.

Тест на пролин. Используют 0,2% раствор изатина в ацетоне, в кото­ром смачивают разлинованную карандашом фильтровальную бумагу. На высушенную бумагу наносят капли исследуемой мочи. Появление ярко-голубой окраски после промывания водой свидетельствует о при­сутствии пролина. Тест применяют в диагностике гиперпролинемии I  и II, синдрома де Тони — Дебре — Фанкони, болезни Вильсона и др.

Тест с FeCl3. Используют 10% раствор FeCl3. Присутствие в моче фенилпировиноградной и имидазолпировиноградной кислот вызывает зеленое окрашивание. Следует иметь в виду, что изменения цвета мочи могут быть и при других заболеваниях (тирозиноз, гистидинемия, лейциноз, алкаптонурия, диабет и др.), при этом окраска мочи может сохра­нять сине-зеленый спектр, а при ряде метаболических расстройств иметь красную или коричневую гамму (диабет, нарушение абсорбции метионина и др.).

Тест с йод-азидом на цистин и гомоцистин. Используют раствор йод-азида. При наличии цистина или гомоцистина моча окрашивается в темно-коричневый цвет. Тест находит применение в диагностике цистинурии, гомоцистинурии, синдрома де Тони — Дебре — Фанкони.

Тест на кетокислоты. Положительная реакция с 2,4-динитрофенил- гидразином характеризуется появлением желтой или оранжевой окрас­ки. Тест используют в диагностике алкаптонурии, фенилкетонурии, лейциноза, гистидинемии и др.

Тест Обермейера на индикан. Используют 0,4% раствор FeCl3 в НС1, хлороформ, .20% раствор гипосульфита натрия. Реакция считается по­ложительной, если в слое хлороформа появляется темно-синяя окраска. Тест применяют в диагностике болезни Гартнепа.

Тест Бенедикта на редуцирующие вещества. Используют реактив Бенедикта. В присутствии редуцирующих сахаров (глюкозы, галактозы, лактозы, маннозы, фруктозы и ксилулозы) моча окрашивается в зеленый или желто-оранжевый цвет. Следует иметь в виду, что при использова­нии в лечении детей сульфаниламидов, антибиотиков и других лекарств может наступать однотипная реакция.

Тест Селиванова на фруктозу. Используют реактив Селиванова (гидрохлорид резорцина). В присутствии фруктозы происходит изме­нение цвета мочи до вишнево-красного. Тест применим в диагностике фруктоземии.

Тест Сульковича на кальций. Используют реактив Сульковича (см. с. 156). В присутствии солей кальция моча мутнеет. Тест имеет значение в диагностике идиопатической кальциемии.

Тест на медь. Используют реактив, состоящий из 0,1 г о-толидина, 0,5 г роданида аммония и 5 мл ацетона. В присутствии меди моча окра­шивается в ярко-синий цвет. Реакцию применяют в диагностике болез­ни Вильсона.

Тест на мукополисахариды. Используют 0,04% раствор толуидинового синего в 0,2% растворе уксусной кислоты; этанол 95%. Положи­тельная реакция характеризуется появлением стойкого пурпурного кольца. Тест применяют в диагностике мукополисахридозов.

Тест на гомогентизиновую кислоту. Используют 10% раствор NaOH. Появление сине-фиолетовой окраски свидетельствует о присутствии в моче гомогентизиновой кислоты. Тест применим в диагностике алкаптонурии.

Необходимо отметить, что качественные пробы с мочой дают лишь предварительную информацию и рассматриваются как ориентирующие врача исследования. Если у детей подозревают наследственные наруше­ния обмена, неизбежен второй этап исследований, при которых исполь­зуют количественные биохимические методы.

Хроматографические методы анализа крови и мочи

Бумажная хроматография аминокислот нашла широкое распростра­нение в диагностике наследственных аминоацидемий (фенилкетонурия, гистидинемия, гомоцистинурия, лейциноз, аргинин-янтарная олигофрения, гиперпролинемия, гиперлизинемия и др.). В медицинской практике используют: одномерную восходящую хроматографию аминокислот мочи и крови; двумерную хроматографию аминокислот мочи.

При интерпретации аминокислотных хроматограмм следует принимать во внимание физиологические колебания их концентрации, влия­ние таких состояний, как физиологическая незрелость ферментативных систем у недоношенных и новорожденных детей, беременность, изме­нение реабсорбции почечных канальцев при болезнях почек и др.

Бумажная хроматография сахаров в моче используется для диагнос­тики глюкозурий различного генеза — энзимопатий или же мутаций транспортного белка в почечных канальцах и кишечнике. Метод приме­ним при обследовании детей с сахарным диабетом, галактоземией, фруктоземией, непереносимостью лактозы и др.

Как и при хроматографии аминокислот, в интерпретации резуль­татов следует иметь в виду физиологическую гиперсекрецию сахаров, беременность, влияние инфекционных заболеваний и пр.

Показания к медико-генетическому консультированию: 1) наличие однотипных заболеваний у нескольких членов семьи; 2) заболевание близнецов; 3) кровное родство родителей; 4) повышенная частота ана­логичных заболеваний в районе проживания семьи;, 5) отставание в умственном развитии (после исключения последствий родовой травмы, нейроинфекций, эпилепсии); 6) отклонения в физическом развитии (гипотрофия, анорексия, хронические расстройства желудочно-ки­шечного тракта); 7) ожирение, сочетающееся с гипогонадизмом, слабоумием, поражением глаз; 8) множественные диспластические признаки; 9) врожденные пороки развития; 10) аномалии костной системы (деформации грудной клетки, искривления позвоночника, особенно в сочетании с поражением глаз, сердечно-сосудистой системы, мышечной и соединительной ткани); 11) .упорно прогресси­рующий рахит, несмотря на общепринятое лечение; 12) семейные слу­чаи бронхолегочных заболеваний, ранняя смерть детей в семье от пнев­монии, сочетание заболеваний легких с расстройствами питания; 13) семейные случаи аллергозов; 14) экзема у детей, особенно в сочетании с неврологической симптоматикой и семейные случаи; 16) наличие ран­них форм гипертонической болезни и инфаркта миокарда у взрослых членов семьи-, артериальная гипертония и (или) ксантоматозные изме­нения кожи у ребенка; 16) гепато- и (или) спленомегалия у ребенка; 17) проявления геморрагического синдрома; 18) семейные заболевания почек; 19) стойкие изменения цвета и запаха мочи, обнаружение са-

Симптоматология важнейших наследственных аномалий обмена веществ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

хара в моче; 20) аномалии строения наружных половых органов; 21) глухота семейная, особенно ее сочетание с поражением внутренних органов; 22) поражение органа зрения, особенно в сочетании с наруше­нием психомоторного развития.

Симптоматология важнейших наследственных аномалий обмена веществ представлена в табл, 175,

 

Comments are closed.